[发明专利]从瓯柑油胞层中分离纯化七种黄酮类化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及以瓯柑油胞层为原料，采用溶剂萃取、Sephadex凝胶过滤和高速逆流色谱（HSCCC）的联用技术同时分离纯化瓯柑油胞层中的七种黄酮类化合物的方法。 

背景技术

瓯柑（Citrus reticulata cv. Suavissima）是芸香科柑橘属的一个栽培变种，是浙江温州的传统特产，有两千多年的栽培历史。瓯柑果实在民间具有抗癌、退热降温、止痰化咳、清凉解毒、改善血液循环、降压等特殊疗效，这些作用可能与其果实中富含的黄酮类化合物有关。前人的研究报道柑橘黄酮类化合物具有抗癌、降糖、降血脂、预防心血管疾病、消炎、神经保护等活性，对人体健康起非常重要的作用。另外，黄酮类化合物也是重要的工业生产前体，如柚皮苷和新橙皮苷常用来生产它们相应的二氢查耳酮类。柚皮苷二氢查耳酮和新橙皮苷二氢查耳酮的甜度分别是蔗糖的300倍和1000倍，而且具有低热量和低啮齿性，可以适合糖尿病人和肥胖人群。同时，将黄酮类化合物添加到牙膏或化妆品中，具有较好的消炎、止血和美白的功效，并且在急性毒理实验中也被证明是安全的，因此，黄酮类化合物的分离纯化具有非常重要的保健价值和工业效益。 

随着近年来对黄酮类化合物的深入研究，市场需求量迅速增大。现有技术中，柑橘黄酮类化合物的提取分离主要采用有机溶剂提取结合结晶法，但这些工艺效率低，生产周期长，污染严重，不利于大量生产。Sephadex 凝胶柱可以综合利用凝胶过滤和反相分配的原理进行天然产物的分离。基于液液分配原理的HSCCC避免了固体支持物或载体带来的样品吸附、变性、污染等缺点，并具有较高的样品回复率。采用溶剂萃取，凝胶过滤和HSCCC的联用技术可有效快速的分离纯化柑橘中的黄酮类化合物。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从瓯柑油胞层分离纯化七种黄酮类化合物的方法，通过以下步骤实现： 

（1）溶剂萃取：一定质量的瓯柑油胞层粉末先用80%乙醇超声提取3次（固液比1:20），每次30 min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，根据溶剂极性依次用正己烷，氯仿，正丁醇萃取两次，分别合并两次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物和正丁醇萃取物；

（2）Sephadex LH-20凝胶过滤：蒸干后的正己烷和氯仿萃取物溶于40%甲醇中，上Sephadex LH-20凝胶柱，上样流速2 mL/min。上样后的Sephadex LH-20凝胶柱依次用体积比为40%，60%，80%，100%甲醇洗脱凝胶柱，每个梯度洗4 个柱床体积，洗脱流速为2 mL/min，洗脱液经HPLC检测，合并富含黄酮类化合物的洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得到去除色素后的黄酮粗提物；

（3）HSCCC分离纯化：配制不同的HSCCC溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至800 rpm，同时流动相以2 mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层后，去除色素后的正己烷和氯仿萃取物分别溶于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比1:0.8:1:1）的下相中，正丁醇萃取物溶于乙酸乙酯-正丁醇-水（体积比4:1:5）下相中，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，用HPLC测定各组分的组成，分别合并含有单一黄酮类化合物的试管，在旋转蒸发仪上50℃蒸干共得到七种黄酮类化合物，分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，产品纯度均在97%以上。本发明纯化得到的七种黄酮类化合物经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）鉴定，与文献报道一致。

本发明的黄酮类化合物的提取材料选自瓯柑油胞层。利用正己烷、氯仿和正丁醇分段萃取瓯柑油胞层中的黄酮类化合物。利用Sephadex LH-20凝胶柱去除正己烷和氯仿萃取物中的色素分子。进行HSCCC纯化时，选择正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:0.8:1:1）的溶剂体系，从正己烷和氯仿萃取物中纯化得到甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，选择乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5）溶剂体系，从正丁醇萃取物中得到柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，纯化得到的七种黄酮类化合物纯度均在97%以上。