[发明专利]盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用

说明书

发明领域

本发明属于生物工程技术领域。具体的说，本发明涉及一种盐穗木金属硫蛋白及其基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体，以及一种重组盐穗木金属硫蛋白及其制备及应用技术领域。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。1957年Margoshes和Valles在研究镉的生物学作用时，从蓄积镉的马肾中首次分离出该物质。MT具有以下几个特征：分子量低，一般为6～7kD；能螯合金属离子，蛋白通过硫酯键与金属结合后，具有特殊的光吸收特征；半胱氨酸含量高，约占氨基酸残基总数的23％～33％，但不形成二硫键，分子中缺乏芳香族氨基酸和组氨酸；半胱氨酸残基在氨基酸序列中具有较为保守的排列方式。金属硫蛋白丰富的巯基含量及重金属结合能力决定了其功能的多样性。

近年来，对MT的研究和应用已经涉及到医药、农业、食品保健及化妆品添加剂、生物工程、环境保护等诸多领域，前景十分广阔。目前的研究证实了金属硫蛋白具有重金属解毒功能、清除自由基、抗辐射和紫外线照射、参与体内微量元素的代谢、防止细胞癌变以及环保作用。随着对金属硫蛋白结构、功能等研究的深入，其用途日益扩大，对其需求量也越来越大。目前国内生产MT的厂家，主要从兔肝中提取，由于MT原料需求特别，且生产工艺复杂，导致目前MT产量不大且价格昂贵。所以迄今为止一直缺乏一种高产量、低成本、安全性高、适宜于规模化生产MT的技术和方法。

综上所述，克隆金属硫蛋白基因，利用基因工程方法生产金属硫蛋白是降低生产成本的一条有效途径，及对其在医药、食品保健及化妆品等领域的应用具有重要的意义。

盐穗木(Halostachys caspica)为藜科盐穗木属，是生长在荒漠、半荒漠盐碱地上的重要盐生、旱生稀盐多汁半灌木植物，对盐分适应性极强，是盐土荒漠主要植物之一。在高盐和重金属胁迫下，其体内的金属硫蛋白基因表达水平呈明显上升趋势。目前还没有盐穗木金属硫蛋白及其基因的报道。

发明内容

针对天然金属硫蛋白含量少，传统生产工艺复杂、提取得率低的现状，本发明提供一种新的盐穗木金属硫蛋白及其基因，含有该基因的重组表达载体、转化体，以及重组盐穗木金属硫蛋白及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一：提供一种盐穗木金属硫蛋白基因，所述的盐穗木金属硫蛋白基因具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为234bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中78个氨基酸组成的蛋白质，富含半胱氨酸。

本发明技术方案之二：提供一种盐穗木金属硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，来源于新疆盐生植物盐穗木的金属硫蛋白。

进一步，本发明提供盐穗木金属硫蛋白基因的获得方法，通过提取盐处理的盐穗木总RNA，反转录cDNA，PCR扩增获得，其具体包括如下步骤：

(1)根据盐穗木盐抑制差减文库中Hc6f12的EST(GenBank登录号HS586469.1)序列的反向互补序列，设计引物用于扩增盐穗木金属硫蛋白基因的开放读码框；引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。

(2)取300mM NaCl处理的盐穗木同化枝，应用RNAsimple Total RNA Kit提取总RNA；以Oligo(dT)为引物，按TaKaRa M-MLV操作说明合成cDNA的第一链，以该cDNA第一链产物为模板进行RT-PCR反应，反应程序：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃1min，30个循环；将PCR产物，连接到克隆载体pMD18-T上，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性单菌落进行菌液PCR和双酶切鉴定并测序，得到如序列表中SEQ I D NO.1所示的带有起始密码子ATG和终止密码子TGA的基因全长序列。

根据本发明，所述的盐穗木金属硫蛋白基因全长为234bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；该序列无内含子，具有完整的开放阅读框，编码78个氨基酸；编码产物，即本发明盐穗木金属硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQ I D NO.2所示；分子量为7.7kD，等电点为4.78；含14个半胱氨酸和15个甘氨酸。