[发明专利]孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及胎儿有核红细胞的分离方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

出生缺陷指婴儿出生时就存在的各种包括身体结构、智力或代谢等方面的异常。我国是世界上缺陷新生儿的高发国家之一，全国每年出生的2000万名新生儿有5%存在出生缺陷，每30秒就有一个缺陷儿出生。出生缺陷可由染色体畸变、基因突变等遗传因素或环境因素引起,也可由这两种因素交互作用或其他不明原因所致。现有的科研成果显示基因突变在出生缺陷及遗传病发生中发挥重要性，所以对胎儿染色体与DNA的产前筛查是降低出生缺陷及遗传病的重要手段。

    胎儿染色体与DNA检测的材料必须来自胎儿自身，传统的产前诊断是建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一定的影响，属于侵入性检查。非侵入性产前诊断已经成为常规产前诊断的一个主要目标，特别是通过富集孕妇外周血中的胎儿有核细胞进行产前诊断，对于以染色体异常和DNA变异为病因的遗传性疾病的早期防治和干预具有重大的意义。可以用于胎儿遗传病产前筛查，安全而易于推广，有着良好的应用前景。 

    目前产前胎儿出生缺陷及遗传病的非侵入性检测方法主要是以孕妇外周血胎儿游离DNA检测和孕妇外周血胎儿有核细胞检测两类。但是孕妇外周血胎儿游离DNA检测有一定的固有局限， 例如游离于母血中的胎儿DNA为短片断，一般小于200bp，无法检测染色体数量与移位异常导致的严重遗传性疾病。而分离得到的胎儿有核红细胞可以检测染色体数量与移位异常的同时，还可以从单个胎儿有核红细胞分离全基因组DNA用于检测，不受DNA长度的限制。因此孕妇外周血胎儿有核细胞检测具有独特的优势, 特别是以母血中的游离胎儿DNA检测作为胎儿遗传病筛查后可疑阳性的受检者需要以孕妇外周血胎儿有核细胞检测结果作为确定诊断的依据。

胎儿细胞能够越过胎盘屏障进入母体血液循环。其中适于做遗传分析的细胞是有核细胞, 即含有DNA、RNA 遗传物质的细胞， 主要包括滋养细胞、淋巴细胞、有核红细胞。研究表明胎儿有核红细胞在孕妇外周血中持续存在，怀孕5周即可分离到足够的胎儿有核红细胞，易于通过形态学辨别，含有胎儿全部基因组等特点，因此是用于产前诊断的最佳细胞类型。

    但是由于通常孕妇外周血中胎儿有核细胞与孕妇有核细胞的比例约为1：106，想使用如此稀少的胎儿有核红细胞进行产前诊断就必须首先将其从母血中分离、纯化出来。目前密度梯度离心法、单克隆抗体标记结合流式细胞分离法等仍处于实验阶段，稳定性和准确性有待改进，还难以广泛应用于临床。

    同时目前国内外各实验室报道的孕妇外周血中胎儿有核细胞的分离技术多种多样,分离和检测效果参差不齐,必需建立敏感性高、特异性强、结果稳定的分离检测技术,以提高鉴定单个有核红细胞的胎源性，为进一步改进和发展无创性产前基因诊奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离方法，本发明方法从孕妇外周血中分离纯化获得胎儿有核红细胞的纯度和回收率高。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离方法，包括以下步骤（1）富集有核细胞：

①采全血；

②离心，收集细胞沉淀物；

③制备细胞悬液：在细胞沉淀物中加入等体积的36～38℃的RPMI1640细胞培养液，RPMI1640细胞培养液中含有质量分数为10%的胎牛血清，充分混匀制得稀释的细胞悬液；

④离心管中预置细胞分离液，加入稀释的细胞悬液于分层液面上；

细胞分离液的组成为：质量分数为9％的聚蔗糖 20～30份、质量分数为33.9％的泛影葡胺5～15份。测比重，用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。

⑤离心，得到细胞层；

⑥吸取细胞层，转移到另一个离心管中，加入Hank^，s液，混匀、室温离心、洗涤细胞；

⑦在步骤⑥的离心管中加入等体积的平衡盐缓冲液，混匀，离心，用平衡盐缓冲液重悬细胞；

（2）母血中胎儿有核细胞筛选：

⑧取步骤⑦重悬后得到的细胞悬液，加入鼠抗人的单克隆抗体试剂，充分混匀，在4℃冰箱中避光反应30分钟；

⑨离心，弃上清液，用平衡盐缓冲液洗涤，离心，弃上清液，收集细胞，分选出胎儿有核红细胞；

⑩分选得到的胎儿有核红细胞图片，进行四重形态学标准鉴定，收集符合标准的胎儿有核红细胞。