[发明专利]葡萄糖氧化酶的分离纯化方法

权利要求书

1.葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、粗酶液的制备：将菌丝研磨，抽提，盐析，得粗酶液；所述的菌丝为收集的产葡萄糖氧化酶的丝状真菌的菌丝；

b、DEAE-Sepharose离子交换层析：用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱，将步骤a得到的粗酶液上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥；

c、Superdex-200凝胶过滤层析：用1个床体积的0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱，将步骤b得到的样品溶解后上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中研磨是指将菌丝体置于研钵中，加入液氮，对菌体进行研磨。

3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中抽提是指研磨后加入预冷的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，按菌丝质量︰缓冲液体积为1︰3，4℃静置30min；抽提完成后4℃12000r/min离心30min，取上清液；所述1︰3的比值单位为g︰mL。

4.根据权利要求1～3任一项所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中盐析包含以下操作：向抽提后的上清液中加入NH₄SO₄至40%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，收集上清液；再加入NH₄SO₄至60%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀，用上清液体积1/10的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，透析后得粗酶液。

5.根据权利要求1～4任一项所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中上样量为10mL，洗脱流速为1.0mL/min，洗脱后每管收集10mL。

6.根据权利要求1～5任一项所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中洗脱流速0.3～0.5mL/min，每管收集3～5mL。凝胶层析分离效果与流速关系最为密切。