[发明专利]葡萄糖氧化酶的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶的分离纯化方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶（GOD）在分离纯化中，回收率不高，影响产品产量；比活力不高影响产品的质量。

葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、无副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，已广泛应用于食品、饲料、医药等行业中。

葡萄糖氧化酶的纯度一直是影响其质量的重要因素，杂质的含量和种类严重制约了葡萄糖氧化酶的应用领域和应用效果。同时高纯度的葡萄糖氧化酶也为酶学性质的研究及机理提供了物质基础。王志新等人通过：黑曲霉A9发酵培养—菌丝体破碎—粗酶液制备—超滤—硫酸铵盐析—Sephadex G-25脱盐—DEAE-纤维素离子交换层析-Sephadex G-100分子筛层析的纯化方案使葡萄糖氧化酶的比活力由初始发酵液的88U/mg提高到1779U/mg，其比活值提高了将近20倍，达到了电泳纯^[1]。中国科学院的周亚凤等人通过离心分离、透析除盐、Sepharose^TMFast Flow离子交换层析盐梯度洗脱的方法纯化了重组酵母的葡萄糖氧化酶，使其比活值达到426.63U/mg，是商品黑曲霉的1.6倍^[2]。但是该酶的纯化效率不高，回收率较低，这使得纯化葡萄糖氧化酶的成本增加，因此该酶的价格较高，使其使用受到限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效分离纯化葡萄糖氧化酶的方法。

本发明的技术方案是葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，包括如下步骤：

a、粗酶液的制备：将菌丝研磨，抽提，盐析，得粗酶液；所述的菌丝为收集的产葡萄糖氧化酶的丝状真菌的菌丝；

b、DEAE-Sepharose离子交换层析：用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱，将步骤a得到的粗酶液上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥；

c、Superdex-200凝胶过滤层析：用1个床体积的0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱，将步骤b得到的样品溶解后上样，洗脱，收集具有GOD酶活性的洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品。

其中，步骤a中研磨是指将菌丝体置于研钵中，加入液氮，对菌体进行研磨。

其中，步骤a中抽提是指研磨后加入预冷的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液，按菌丝质量︰缓冲液体积为1︰3，4℃静置30min；抽提完成后4℃12000r/min离心30min，取上清液；所述1︰3的比值单位为g︰mL。

其中，步骤a中饱和包含以下操作：向抽提后的上清液中加入NH₄SO₄至40%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，收集上清液；再加入NH₄SO₄至60%饱和度，放置2h后8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀，用上清液体积1/10的0.05mol/L pH7.1Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，透析后得粗酶液。

其中，步骤b中上样量为10mL，洗脱流速为1.0mL/min，洗脱后每管收集10mL。

其中，步骤c中洗脱流速0.3～0.5mL/min，每管收集3～5mL。

本发明步骤b中冷冻干燥是为了浓缩酶液，使其活力更高，利于增加凝胶层析上样量，增加分离效率。

本发明的有益效果：本发明分离得到葡萄糖氧化酶纯品，该酶的比活力为28930.6U/mg，回收率为39.5%，纯化倍数为393.6倍。本实验流程简单，便于操作，且生产成本较低，可用于大规模生产，具有较好的经济发展前景。这为该酶的高效分离纯化提供了技术支持。

附图说明

图1黑曲霉H1-9b所产GOD的DEAE-Sepharose离子交换层析曲线

——所示为蛋白含量  所示为酶活力   －－－－－所示为NaCl浓度

图2黑曲霉H1-9b所产GOD的Superdex-200凝胶过滤层析曲线

——所示为蛋白含量所示为酶活力

图3黑曲霉H1-9b所产GOD的SDS-PAGE电泳图谱