[发明专利]一种枯草芽孢杆菌菌株A33、菌剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株A33、菌剂及制备方法和应用。 

背景技术

设施农业生产属于人为控制下的半封闭式生态系统，除夏、秋季遮阳网覆盖栽培外，相比露地栽培生态系统具有温度高、温差大、弱光、高湿和气流缓慢等特点，有利于植物病害的发生。由此导致的作物损失接近总产量的三分之一左右，造成巨大的经济损失。长期以来，对于植物病害的防治主要依赖于化学农药的使用。然而，化学农药的滥用，也导致了严重后果，如环境污染，土壤生态多样性破坏以及对农作物及人类产生的药害等。因而，各国研究人员一直在探索新的控制作物病害的方法，来降低乃至替代化学农药的使用，来维护食品和环境安全，保护人类健康。 

生物防治即利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治策略，是目前国内外针对植物病害的有效防治措施之一。从自然界中分离、筛选出有益微生物再应用其对病原微生物的拮抗、抑制作用进行有效防控，该方法具有安全、高效、无公害和低成本等特点，且不会引起病原菌产生相应的耐药性。因此，利用拮抗微生物进 行生物防治已成为当前植物病害防治的重点发展方向。 

芽孢杆菌（Bacillus）是土壤和植物微生态中的优势微生物种群之一，其生长迅速，对营养要求单一，抗逆性强，由于可以产生多肽类抗菌素以及对活菌体具有溶菌作用的酶，因而对多种植物病原微生物具有拮抗作用。而且，芽孢杆菌所产生的芽孢对于紫外线辐射、低温、干燥等环境具有良好的耐受性。作为自然界中广泛存在的非致病菌，枯草芽孢杆菌对人畜无害且不会造成环境污染。是一种较为理想的生防微生物，也是目前国内外选育生防菌的主要来源之一。 

近年来的大量研究发现，许多芽孢杆菌在植物微生态环境中能够与植物形成共生关系，在植物组织和叶际的微生态环境中迅速定殖生长。此外，在植物根际生活的部分芽孢杆菌还可以有效分解土壤中的硅酸盐类矿物质，使土壤中难溶性的K、P、Si等元素转变为可溶性物质供植物生长利用，同时其产生的多种活性物质还能够促进植物生长。上述的这些特性都是开发具有广谱抗菌性，以及抗病促生多种功效的生防菌剂的必要条件，具有良好的开发前景，因此芽孢杆菌生防菌剂的开发一直是国内外生物防治领域的重要热点。 

发明内容

本发明的目的之一是针对设施农业栽培中白粉病、霜霉病、灰霉病等病害的防治，提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌菌株A33。 

本发明的目的之二是提供一种利用枯草芽孢杆菌A33生产的微生物菌剂、该微生物菌剂的制备方法以及使用方法和该微生物菌剂在 防治设施蔬菜栽培中白粉病、霜霉病、灰霉病等真菌病害的应用。 

本发明采用的技术方案是，一种枯草芽孢杆菌菌株A33（Bacillius subtilis A33），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7468。 

本发明所采用的另一技术方案是，一种微生物菌剂，活性成分为枯草芽孢杆菌A33菌体、芽孢及其胞外代谢产物。菌剂为液态菌剂。 

本发明所采用的第三个技术方案是，一种微生物菌剂的制备方法，具体按照以下步骤实施： 

步骤1、菌种活化： 

将低温保藏的A33菌株接种LB固体培养基上，并在28-37℃下培养18～24小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～37℃下培养18～24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，将洗脱液作为接种液； 

步骤2、种子液的制备： 

在LB液体培养基中接入步骤1制备的接种液，所用培养基和接种液的体积比为1：0.05%～0.5%，在28～37℃下震荡培养12～18小时，得到种子液； 

步骤3、发酵培养： 

将步骤2所得种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基发酵培养基和种子液的体积比为1：1%～1：10%，在28～37℃、摇床转速为150～23Orpm的条件下培养32-44小时，得到菌株A33的液体制剂；发酵培养基的组分为：蔗糖2%～4%，玉米淀粉2%～4%，豆饼 粉0.5%～1.5%，NaCl0.3%～0.5%，CaCO₃0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O0.02～0.04%，余量为水，以上各组分的质量百分比之和为100%，pH7.0-7.5。 

步骤4、液体菌剂制备： 

将步骤3得到的发酵液与表面活性剂混匀后制成微生物菌剂。