[发明专利]一种检测环境雌激素的重组酵母及其构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测环境雌激素的重组酵母及其构建方法和用途。

背景技术

激素是生物内分泌细胞分泌的高效生物活性物质，具有低浓度、高效力的特点。

环境激素是指环境中存在的，能够模拟天然激素的作用，对生物的内分泌系统等产生严重影响的某些有毒化合物。

环境雌激素是最主要的一类环境激素，是生殖障碍、生殖系统畸形、发育异常、代谢紊乱以及某些恶性肿瘤发病率增加的主要原因之一。由于环境雌激素种类多、危害大、分布广、作用机制复杂，其对生物体与环境的危害逐步被人们所重视。因此建立快速、灵敏、高效、低成本的针对环境雌激素的检测方法已成为当务之急。

目前环境雌激素的检测方法主要有化学分析方法和生物学检测方法。

化学分析方法主要为一些色谱及质谱法，仪器昂贵，操作复杂，对样品的前处理过程要求非常高，检测样品较单一，具有一定的应用局限性。

而生物学检测方法中，重组基因酵母检测法较为常见，主要是用人雌激素受体基因构建表达质粒，用雌激素效应元件序列片段连接报告基因构建报告质粒。这不利于与一些在体实验、胚胎致畸实验和种群生态实验等相互印证。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测环境雌激素的重组酵母。

本发明的另一目的在于提供上述的检测环境雌激素的重组酵母的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述的检测环境雌激素的重组酵母的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测环境雌激素的重组酵母，含有酵母表达质粒和酵母报告质粒。

所述的酵母表达质粒包含序列如SEQ ID No.1所示的唐鱼雌激素受体基因TERα。在表达载体中插入的是唐鱼雌激素受体基因，能够更好地受唐鱼卵黄蛋白原启动子的调控。

所述的酵母报告质粒，其载体是pMP206，载体上连接序列如SEQ ID No.4所示的唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2（promoter2）。pMP206是常用的附加型酵母载体，其上带有氨苄青霉素的抗性基因(Amp^r)和营养缺陷型标记URA3基因，可以分别作为大肠杆菌和酵母系统中的筛选标记；同时还带有一个编码β-半乳糖苷酶的全长LacZ报告基因，基本启动子为细胞色素氧化酶基因启动子(CYC1)，该启动子上游有可用于插入待研究的外源性基因的惟一酶切位点Hind III和Pst I，因此可将唐鱼卵黄蛋白原启动子序列插入其上游，从而构建报告质粒。因为本发明的唐鱼卵黄蛋白原基因启动子序列上含有雌激素反应元件ERE，因此能特异性地对雌激素刺激产生反应。

所述的酵母是酵母菌株AH109（MATa型），AH109是带有营养缺陷筛选标记的菌株。

所述的酵母表达质粒，其载体优选pGADT7。pGADT7是常用的附加型酵母载体，其上携带的氨苄青霉素的抗性基因(Amp^r)和营养缺陷型标记LEU2可以分别作为大肠杆菌和酵母系统中的筛选标记。

所述的环境雌激素是雌二醇，优选17-β雌二醇。

上述的检测环境雌激素的重组酵母的构建方法，包括以下步骤：

（1）将唐鱼雌激素受体基因TERα序列连接到载体上，构建表达质粒；

（2）将唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2（promoter2）序列连接到载体pMP206上，构建报告质粒pMP206/pr2；

（3）将上述的表达质粒和报告质粒转染酵母细胞，得到检测环境雌激素的重组酵母。

上述的重组酵母可用于检测环境雌激素，包括以下步骤：

将上述的重组酵母置于添加有CuSO₄的液体SD培养基中，加入待测样品，30℃下振荡培养18h，测定β-半乳糖苷酶活性，根据β-半乳糖苷酶活性的变化计算待测样品中雌激素的含量；

所述的液体SD培养基不含亮氨酸（Leu）和尿嘧啶（Ura），其中CuSO₄的质量体积浓度是0.1%。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：