[发明专利]基于荧光素酶标记工程菌的氟喹诺酮类药物残留检测方法

说明书

技术领域

本方法属于兽药残留分析和基因工程技术领域。具体涉及能同时检测11种氟喹诺酮类药物的荧光素酶标记基因工程菌的构建、同时检测11种氟喹诺酮类药物的检测方法的建立。

背景技术

氟喹诺酮类药物是一类重要的化学合成抗菌药。此类药物抗菌谱广、抗菌活性强，是兽医临床常用药品。由于未按照休药期规定使用兽用氟喹诺酮类药物或者将人用氟喹诺酮类药物使用在动物上，导致其在畜禽和水产品中残留严重。氟喹诺酮类药物在动物源性食品中的残留除了对人体有直接的危害作用外，也影响了我国进出口贸易。我国农业部(2002)、世界卫生组织、欧盟及世界各国均规定了氟喹诺酮类药物在动物源性食品中的最高残留限量(Maximum Residue Limit,MRL)。

目前用于检测氟喹诺酮类药物残留的方法有理化分析法、免疫分析法和微生物分析法等。理化分析法主要用于确证，亦可用于筛选，但需要昂贵的仪器作为检测的保证，且其前处理程序较复杂并不适合大量检测。免疫分析方法灵敏度高、特异性强，但它不能同时检测多种氟喹诺酮类药物，且抗体制备过程复杂。传统的微生物分析法操作简便、样品前处理简单，可以实现氟喹诺酮类药物的多残留检测，但是该方法难以定量且灵敏度低。荧光标记工程菌技术，又称作生物发光微生物传感器技术，是一种比传统的微生物学方法灵敏度更高，且可以检测一类甚至多类物质，在生物检测领域有着极其广泛的应用，如环境污染物重金属离子、氧化性应激性物质、硝酸盐、DNA损伤剂等。

目前已经有一些文献报道了荧光标记工程菌技术在抗菌药物残留检测中的应用，例如四环素类[Korpela et al.,Anal.Chem.,1998,70(21),pp4457–4462;Pellinen et al.,J.Agric.Food Chem.,2002,50(17),pp4812–4815]和β-内酰胺类抗生素(Valtonen et al.,J.Biomol.Screen,2002,7(2),pp127-134)等。该技术最近也用于氯霉素和氟喹诺酮类的药物检测。Shapiro等[Shapiro et al.,J.Biotechnol.,2007,4(132),pp487-493]比较两种融合蛋白cspA::lacZ和cspA::luc检测氯霉素的效果，结果显示萤火虫荧光素酶比β-半乳糖苷酶更快速灵敏；SOS诱导型启动子sulA与lucR1融合蛋白检测氧氟沙星检的测限相当于其MIC的15%；他们将cspA::lacZ和sulA::lucR1结合构建一种同时检测氯霉素和氧氟沙星的生物传感器。

本申请人所在的华中农业大学国家兽药残留基准实验室前期研究了荧光标记工程菌技术在氟喹诺酮类药物检测中的应用(黄明威，华中农业大学硕士学位论文，2010，华中农业大学图书馆，中国知网)，将质粒pRecAlux3(recA’::luxCDABE)[该质粒由Vollmer等人构建用来检测丝裂霉素等DNA损伤剂(Vollmer et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(7),pp2566-2571)]转化至大肠杆菌ATCC128中，构建了一株敏感性和特异性较好的荧光素酶标记基因工程菌大肠杆菌pR128，建立了猪肝脏、肾脏、肌肉和牛奶这四种组织中氟喹诺酮类药物残留的检测方法，其最低检测限(Limit of Detection,LOD)为50μg/kg，低于欧盟和我国的MRL。然而，该研究所构建工程菌株在稳定性方面存在缺陷，组织样品检测范围不够广，在实际应用中还有待进一步完善。本发明的目的是筛选并构建一株对氟喹诺酮类药物敏感、特异性好、且在传代过程中可以稳定检测氟喹诺酮类药物的荧光素酶标记基因工程菌，并建立能适用于多种可食性动物产品中氟喹诺酮类药物的多残留检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选并构建出一株对氟喹诺酮类药物敏感、特异性好、且在传代过程中可以稳定检测的荧光素酶标记基因工程菌。

本发明的第二个目的是利用该基因工程菌，建立一种能用于组织样品中多种氟喹诺酮类药物残留检测的分析方法。该方法的组织样品前处理过程简单、涵盖的组织样品范围广(包括牛奶、鱼肉、鸡肉、牛肉、猪肉、鸡肝脏、鸡肾脏、牛肝脏、牛肾脏、猪肝脏和猪肾脏)、操作简便快捷。

本发明的第三个目的是在组织样品中的氟喹诺酮类药物种类已知时，可以对其进行半定量分析。