[发明专利]一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成：RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒和实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-129的表达水平，miR-129表达水平低说明预后好。

2.权利要求1所述的判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有2ml的消毒离心管，1.5ml二甲苯，1.5ml无水乙醇蛋白酶K50μl，Trizol试剂1ml、氯仿200ul、异丙醇500ul、显色剂1ul、75%乙醇1ml和无核酸酶水10-50ul。

3.权利要求1所述的判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RT-PCR试剂盒含有10mM dNTPs0.15ul，50U/ul逆转录酶1ul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul，购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-129特异性逆转录引物3ul和无核酸酶水6.66ul。

4.权利要求1所述的判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于实时定量PCR反应试剂盒含有TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物10ul、无核酸酶水7.67ul和购自Applied Biosystem的20倍浓度miR-129特异性PCR引物1ul。

5.权利要求1至4任一项试剂盒的使用方法：

a、使用RNA提取试剂盒

1)将10张5μm厚连续切片(切片机和刀片均经75%乙醇溶液消毒2次)的蜡膜放于2ml的消毒离心管里，加入1.5ml二甲苯，盖紧并充分混匀去除石蜡，55℃孵育10min，室温下12000r/min离心2min，弃去上清液，重复1次；

2)加入1.5ml无水乙醇，充分混匀以去除二甲苯，室温放置10min，室温下12000r/min离心2min，弃去上清液，重复2次；

3)打开离心管盖子，室温或37℃晾干，约10min，直到乙醇完全挥发；

4)加细胞裂解液250μl，混匀，加蛋白酶K50μl，56℃消化1h，直到样品完全裂解；

5)90℃孵育15min，4℃8000r/min离心，弃去沉淀；

6)加入1ml TRIzol溶液，用1000μl移液器反复抽吸匀浆，室温放置5min，使样品充分裂解；

7)每1ml的TRIzol溶液中加入200μl的氯仿，充分振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相；

8)4℃12000r/min离心10-15min。混合溶液会分成三层：下层为黄色的有机相，中间层和上层无色的水相。RNA主要在水相中，把上层的水相(通常可吸取550μl左右)转移到新离心管中；注意不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染；

9)加入等体积冰冷的异丙醇和1ul显色剂，充分混匀以沉淀其中的RNA，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底，可见蓝色沉淀；

10)4℃12000r/min离心10min，弃去上清液，RNA沉淀于管底和管壁；

11)RNA沉淀中加入1ml75%乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

12)4℃8000r/min离心1-2min，用移液器小心吸取并弃去上清液，注意不要吸弃沉淀；室温放置1-2分钟晾干沉淀。注意RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解；

13)沉淀中加入10-50μl DEPC水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，放置于-80℃冰箱保存；

b、使用RT-PCR试剂盒：

1)、将10mM dNTPs0.15ul，逆转录酶1ul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul，购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-129特异性逆转录引物3ul、无核酸酶水6.66ul、2.5ul RNA试剂盒提取的样品混匀瞬离，分装，加入对应的模板混匀，再加入无核酸酶水至总体系为15ul；

2)、将步骤1的材料在普通PCR仪上进行逆转录，16℃保持30min，42℃保持30min，85℃保持5min，4℃保存；

c、使用实时定量PCR试剂盒：

1)将10ul TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物、7.67ul无核酸酶水、1ul购自Applied Biosystem的20倍浓度miR-129特异性PCR引物、RT-PCR试剂盒获得的miRNA逆转录产物1.33ul混匀；

2)在普通PCR仪上反应，a)95℃保持10min，b)95℃保持15s，c)60℃保持60s，d)重复步骤b)、c)45次，g)4℃保存。