[发明专利]一种拟小叶喇叭藻组织培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种拟小叶喇叭藻组织培养的方法。

背景技术

拟小叶喇叭藻（Turbinaria conoides）隶属于褐藻门、墨角藻目、马尾藻科、喇叭藻属，是我国常见的一种大型褐藻。拟小叶喇叭藻中含有丰富的海洋甾体化合物如海洋甾醇，海洋甾醇与陆生植物的甾醇相比，具有更为丰富的骨架和支链，这种独特的结构赋予它具有抗肿瘤、抗病毒、消炎杀菌的特殊功效，且可以用来制备酶抑制剂，因此，海洋甾体化合物成为医疗与制药业中引人瞩目的一类成分。

目前，拟小叶喇叭藻主要以野生资源为主，但是野生资源也不丰富；人工栽培技术还不成熟，限制人工育种的主要因素是种藻来源不稳定、种质资源匮乏。植物组织培养技术可以快速繁殖，周年生产，不受季节限制；种苗整齐度高，可以进行新品种培育，所需材料较少，繁殖系数大，可以在一年内由一个茎段培养出数百万种苗。海洋植物的组织培养技术比较落后，究其主要原因是无法获得大量无菌且可行的外植体，海藻主要是由细胞组成，虽然大型海藻的结构相对复杂，但是消毒剂的种类和剂量对外植体的影响非常显著，剂量高容易杀死外植体，而剂量低又不容易杀死进入到海藻细胞内部的细菌或真菌。并且，海洋植物组织培养中培养基的种类和激素配比还处于探索阶段，所以拟小叶喇叭藻的植物组织培养技术还比较落后，很难诱导出愈伤组织、芽或者根，或者诱导率极低。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种拟小叶喇叭藻组织培养的方法，拟小叶喇叭藻的假根外植体可以形成大量的再生芽，为拟小叶喇叭藻提供丰富的种质资源。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种拟小叶喇叭藻组织培养的方法，包括如下步骤：

（1）制备外植体：以拟小叶喇叭藻的假根作为外植体，用毛刷将外植体上附着的杂藻等附着物清除干净后，将外植体置于浓度为1～5%的链霉素中浸泡2～4h，然后再将外植体取出，于1%聚维酮碘中消毒1～3min，，再将外植体取出放入浓度为1～3%的次氯酸钠溶液中消毒1～5min，最后用冷却的过滤高压灭菌海水冲洗干净；

（2）接种：无菌操作台中将假根外植体切成长度为0.2-0.5cm的切段，并将切段接种到液体再生诱导培养基中，每个培养皿中接种5个切段；

（3）培养：摇床培养，摇床的速度为80～100r/min，培养条件为光强4000～5000Lx、光照时间12h、温度18～22℃，培养4-6周至再生芽形成。

优选的，所述的链霉素的浓度为2%，浸泡时间为3h。

优选的，所述的聚维酮碘的消毒时间为2min。

优选的，所述的次氯酸钠的浓度为2%，消毒时间为3min。

优选的，所述的拟小叶喇叭藻的再生诱导培养基的配方为：以PES培养基为基本培养基，1L PES培养基中添加NAA  0.5～4mg、KT 0.5～2mg、抗坏血酸5～10mg、蔗糖30g。

优选的，所述的拟小叶喇叭藻的再生诱导培养基的配方为：以PES培养基为基本培养基，1L PES培养基中添加NAA 2mg、KT 1mg、抗坏血酸7mg、蔗糖30g。

本发明的有益效果是：

以拟小叶喇叭藻的假根作为外植体，链霉素、聚维酮碘和次氯酸钠配合使用可以获得丰富的无菌外植体，以PES为基本培养基，添加NAA和KT后有效的促进假根外植体再分化，形成大量的再生芽，诱导率高达81%。

具体实施方式

以下通过实施例进一步阐述本发明的有益效果：

实施例1：

以拟小叶喇叭藻的假根作为外植体，用毛刷将外植体上附着的杂藻等附着物清除干净后，将外植体置于浓度为2%的链霉素中浸泡3h，然后再将外植体取出，于1%聚维酮碘中消毒2min，，再将外植体取出放入浓度为2%的次氯酸钠溶液中消毒3min，最后用冷却的过滤高压灭菌海水冲洗干净；无菌操作台中将假根外植体切成长度为0.2-0.5cm的切段，并将切段接种到培养基中，每个培养皿中接种5个切段，共接种100块切段；摇床培养，摇床的速度为80～100r/min，培养条件为光强4000～5000Lx、光照时间12h、温度18～22℃；培养基的配方为1L PES培养基中添加NAA 0.5mg、KT 0.5mg、抗坏血酸5mg、蔗糖30g；培养4周至再生芽形成，100块切段中，有68块切段有芽形成，诱导率为68%。

实施例2：