[发明专利]一种沙格列汀手性中间体的合成方法

权利要求书

1.一种来源于地芽孢杆菌（Geobacillus sp.）的苯丙氨酸脱氢酶（PDH）突变体，其特征在于，与野生型PDH相比，在氨基酸序列的第93和288位氨基酸残基有取代突变，并具有提高的酶活力和/或热稳定性；其中，PDH氨基酸序列的编号以SEQ ID NO：1为基准。

2.权利要求1所述的PDH突变体，其与野生型PDH相比，仅在氨基酸序列的第93和288位氨基酸残基有取代突变。

3.权利要求1或2所述的PDH突变体，其氨基酸序列的第93和288位氨基酸残基分别突变为亮氨酸（L）和缬氨酸（V）。

4.权利要求3所述的PDH突变体，其氨基酸序列的第93和288位氨基酸残基的取代突变分别为I93L和L288V。

5.权利要求1所述的PDH突变体，其还在氨基酸序列的第75、184和301位氨基酸残基有取代突变。

6.权利要求5所述的PDH突变体，其与野生型PDH相比，仅在氨基酸序列的第75、93、184、288和301位氨基酸残基有取代突变。

7.权利要求5或6所述的PDH突变体，其氨基酸序列的第75、93、184、288和301位氨基酸残基分别突变为丙氨酸（A）、亮氨酸（L）、谷氨酸（E）、缬氨酸（V）和丝氨酸（S）。

8.权利要求7所述的PDH突变体，其氨基酸序列的第75、93、184、288和301位氨基酸残基的取代突变分别为M75A、I93L、K184E、L288V和V301S。

9.权利要求1-8任一项所述的PDH突变体，其中，所述地芽孢杆菌为Geobacillus sp.Y412MC61。

10.权利要求9所述的PDH突变体，其中，所述野生型PDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

11.权利要求10所述的PDH突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5或6所示。

12.编码权利要求1-11任一项所述的PDH突变体的核酸分子。

13.包含权利要求12所述的核酸分子的载体。

14.权利要求13所述的载体，其为pET21a载体。

15.包含权利要求13或14所述的载体的宿主细胞。

16.权利要求15的宿主细胞，其为大肠杆菌。

17.权利要求16所述的宿主细胞，其为大肠杆菌BL21(DE3)。

18.权利要求1-11任一项所述的PDH突变体或权利要求15-17任一项所述的宿主细胞在合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸（Boc-HAG）中的用途。

19.权利要求1-11任一项所述的PDH突变体或权利要求15-17任一项所述的宿主细胞在合成沙格列汀中的用途。

20.一种合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸（Boc-HAG）的方法，包括以下步骤：

（1）在还原型辅酶I（NADH）的存在下，用权利要求1-11任一项所述的PDH突变体催化酮酸底物2-(3-羟基-1-金刚烷基)-2-乙醛酸还原氨化得到S-型的氨基酸(S)-(3-羟基-1-金刚烷基）-D-甘氨酸（HAG）；

（2）在甲酸铵存在下，甲酸脱氢酶（FDH）使NADH再生；

（3）HAG上引入叔丁氧羰基（Boc）保护基得到Boc-HAG。

21.权利要求20所述的方法，其中，所述FDH来源于毕赤氏酵母（Pichia pastoris）。

22.权利要求21所述的方法，其中，所述FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

23.权利要求20-22任一项所述的方法，其中，催化反应在30℃，40rpm下进行，反应时间为20小时。

24.一种合成沙格列汀的方法，包括使用权利要求20-23任一项所述的方法合成手性中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸（Boc-HAG）。