[发明专利]一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe，所述278位的Phe突变为Ile或Gly。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2或SEQ NO.3。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ NO.4或SEQ NO.5。

4.权利要求1～3任意一项突变体在去除油脂产品中偏甘油酯的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用偏甘油酯脂肪酶突变体制备突变体表达质粒：

a、利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；

b、将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到突变体表达质粒；

（2）利用突变体表达质粒制备重组菌株：

a、将步骤（1）的突变体表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；

b、将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株；

（3）将重组菌株重组表达的偏甘油酯脂肪酶用于去除油脂产品中的偏甘油酯。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述PCR的引物序列如下：

SMG For5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’

3'AOX5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’

Phe278Ile For5'-GCTCGCGAGTTCAACATTGACGACCACCAAG-3'

Phe278Ile Rev5'-CTTGGTGGTCGTCAATGTTGAACTCGCGAGC-3'

Phe278Gly For5'-GTTGCTCGCGAGTTCAACGGTGACGACCACCA

AGGTAT-3'

Phe278Gly Rev5'-ATACCTTGGTGGTCGTCACCGTTGAACTCGCGA

GCAAC-3'。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33（Pichia pastoris）。