[发明专利]一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用。

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3）即三酰基甘油酰基水解酶，能够催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。而偏甘油酯脂肪酶是一种只水解甘油单酯和甘油二酯，而不水解甘油三酯的一种脂肪酶。脂肪酶参与的催化反应类型广泛，包括催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品行业、生物医药、日用化工等领域。

偏甘油酯脂肪酶特异的底物选择特性可以被利用于将油脂中的甘油单酯和甘油二酯选择性地去除。专利JP62061590公开了一种利用混合的催化剂Lipase G和Rhizopus deremer lipase制备低甘油二酯含量的硬质奶油。中国专利201210549885.1公开了一种利用混合的偏甘油脂肪酶和单甘油脂肪酶用于去除油脂中的偏甘油酯。尽管这些方法可以有效地降低油脂中偏甘油酯的含量，但是需要使用两种不同类型脂肪酶制剂，增加了生产过程中的成本投入，从而导致最终产品价格的上升。使用高水解甘油单酯和甘油二酯的活性的偏甘油脂肪酶，用去除偏甘油酯是一种可行的方法，但此类型的脂肪酶试剂仍然缺乏。

蛋白质工程是一种能够改善酶蛋白质特性的可行的方法，借助分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得性能提高蛋白或酶突变体，由于该方法具有工作量小和获得阳性突变体的概率大，因此被广泛应用于酶分子改造的应用领域。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种对偏甘油酯水解活性提高的SMG1脂肪酶突变体，可以应用于选择性去除油脂产品中的偏甘油酯。通过理性选择突变位点，是由马拉色霉菌属（Malassezia globosa）SMG1脂肪酶基因（Genbank登录号XM_001732152.1），通过对其蛋白结构（PDB：3UUE）的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。进行定点突变获得酶突变体，亲本SMG1氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述偏甘油酯脂肪酶突变体为：Phe278Ile和Phe278Gly。

本发明的技术方案具体如下：

一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe，所述278位的Phe突变为Ile或Gly。

所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2或SEQ NO.3。

所述突变体的氨基酸序列为SEQ NO.4或SEQ NO.5。

上述突变体在去除油脂产品中偏甘油酯的应用。该应用主要包括如下步骤：

（1）利用偏甘油酯脂肪酶突变体制备突变体表达质粒：

a、利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；

b、将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和SalI分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到突变体表达质粒；

（2）利用突变体表达质粒制备重组菌株：

a、将步骤（1）的突变体表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；

b、将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株；

（3）将重组菌株重组表达的偏甘油酯脂肪酶用于去除油脂产品中的偏甘油酯。

步骤（1）所述PCR的引物序列如下：

SMG For5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’

3'AOX5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’

Phe278Ile For5'-GCTCGCGAGTTCAACATTGACGACCACCAAG-3'

Phe278Ile Rev5'-CTTGGTGGTCGTCAATGTTGAACTCGCGAGC-3'

Phe278Gly For5'-GTTGCTCGCGAGTTCAACGGTGACGACCACCA