[发明专利]检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、阿德呋啉标准品、阿德呋啉抗体工作液、阿德呋啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

2.检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、阿德呋啉标准品的制备、阿德呋啉抗体工作液的制备、阿德呋啉酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

3.根据权利要求2所述的检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的酶标板制备方法为将阿德呋啉半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到阿德呋啉包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

4.根据权利要求2所述的检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：阿德呋啉标准品的浓度分别为0 ng/mL、0.1ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL。

5.根据权利要求2所述的检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的阿德呋啉抗体工作液是采用阿德呋啉人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。

6.根据权利要求2所述的一种检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的阿德呋啉酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2 mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，其为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含0.5% 吐温-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法的特征在于：预处理待测样品，取包被有阿德呋啉抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、阿德呋啉酶标二抗工作液、阿德呋啉抗体工作液各50 μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，拍干后加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20 min，加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据），以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中阿德呋啉的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：a.准确称取5.0±0.05g匀浆样品至50 mL离心管中；

b.先加入有机溶剂10mL和1g无水硫酸钠，用涡旋仪充分振荡涡动10min；

c.5000 r/min离心10 min；

d.取上清液3 mL于50~60℃氮气流下吹干；

e.加入1 mL正己烷(脂肪含量高的样品可加入2mL正己烷)，充分涡动10 s，再加入1 mL样品稀释液，低速涡动10 s；4000 r/min，离心5 min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质；

f.取下层50 μL用于分析。