[发明专利]检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测鸡肉组织中阿德呋啉的酶联免疫试剂盒。

背景技术

当前由艾美耳属球虫引起鸡球虫病的危害程度非常高，严重影响家禽生长发育并造成环境污染。阿德呋啉属核苷酸类化合物，在国外已经有很多研究，属于一种新型的高效抗球虫药物，它通过干扰球虫的嘌呤代谢而发挥抗球虫作用，其抗球虫作用峰期为球虫的无性生殖期，即在球虫感染后1 ～ 3 d 作用最强。阿德呋啉是由是安徽农业大学药理学实验室和南京农业大学药理学实验室共同研发的新一代抗球虫药物，具有抗球虫谱广、高效、低毒等优点，对柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫都有效。近年来，由于家禽养殖规模的不断扩大，全国范围内球虫病的频繁爆发致使各种抗球虫药大量使用。另外，有些养殖户为了经济利益，不合理使用抗球虫药且不遵照休药期规定。由于阿德呋啉在鸡体内代谢主要以原药形式存在，并以原药形式排泄，因此造成该药在鸡肉组织中的残留及对环境的污染。如果人体经常摄入低剂量的同样残留物，会导致体内耐药性细菌的增加及对临床上治疗感染性疾病造成困难；同时，由于残留物在体内蓄积，导致各种器官病变，甚至癌变，这将对我国动物产品质量安全和消费者健康造成严重威胁。国内尚没有鸡肉中阿德呋啉残留检测的相关报道，因此，有必要建立一种鸡肉组织中阿德呋啉残留的检测技术。。

酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、阿德呋啉标准品、阿德呋啉抗体工作液、阿德呋啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、阿德呋啉标准品的制备、阿德呋啉抗体工作液的制备、阿德呋啉酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由阿德呋啉抗原包被制备，具体步骤是将阿德呋啉半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将阿德呋啉包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

阿德呋啉标准品浓度分别为0 ng/mL、0.1ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL。

所述阿德呋啉抗体工作液是采用阿德呋啉人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。

所述阿德呋啉酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2 mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5% 吐温-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有阿德呋啉抗原的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中，加入阿德呋啉酶标二抗工作液，50 μL/孔，然后加入阿德呋啉抗体工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；