[发明专利]高效全血基因组DNA提取方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种快速、高效全血基因组DNA提取方法，属于核酸纯化领域。

背景技术

目前，分子生物学理论和技术发展十分迅速，已经与生物学、医学、遗传学和动物学等多个学科密切结合，获得高纯度和完整的基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础，是其它研究工作的前提。外周血可作为造血系统疾病研究中分子标志，以及用于体外诊断系统的开发，还可用于血液系统外众多系统疾病的分子监测。从外周血中提取DNA，进行核酸水平的研究是临床分子生物学重要的研究手段。

在遗传性疾病和肿瘤以及心脑血管病等研究中，可以利用外周血作为生物材料，检测患病个体与正常健康个体之间的DNA差异，例如DNA甲基化分析和基因突变检测。寻找快速、经济的DNA提取方法是群体分子生物学实验面临的首要问题。然而，从血液中提取DNA面临的难题之一是DNA易受到多种物质的污染，使得DNA纯度下降，致使实验结果准确性降低。有些传统的外周血DNA提取方法使用饱和酚等有害物质，且操作复杂，过程繁琐，用时过长；开放的自动化DNA提取装置，虽然不再使用饱和酚等有害物质，操作过程也相对比较简单，但所用仪器和试剂极为昂贵，不适用于普通实验室大规模DNA的提取。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、高效提取全血基因组DNA方法，保证提取出的基因组DNA完整，并使提取过程高效、快速、无毒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种高效全血基因组DNA提取方法，包括以下步骤：

（1）按全血：红细胞裂解液=1：1的体积比，向EP管中的全血中加入红细胞裂解液，涡旋2分钟后静置5分钟以上，直至溶液澄清透明，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液；

（2）向步骤（1）的EP管中再加入占全血体积1/3的红细胞裂解液，涡旋1分钟，直至沉淀完全散开，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃去上清液；重复本步骤一次，并用吸水纸吸干残留液体；

（3）向步骤（2）的EP管中加入占全血体积1/3的白细胞稀释液，另加入占全血体积1/600的蛋白酶K，混匀，37^oC水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解；

（4）向步骤（3）的EP管中分别加入占全血体积1/12的5摩尔/升氯化钠溶液和占全血体积2/3的氯仿，充分摇匀，然后对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟，将上层液体转移至另一洁净的EP管中；

（5）向步骤（4）的洁净的EP管中加入占管内溶液1／10体积的醋酸铵溶液和2倍体积的冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA，然后对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃去上清液；

（6）向步骤（5）的洁净的EP管中加入占全血体积1/3的75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，然后进行离心分离，转速为12000转／分，离心时间为1分钟，弃去上清液；重复本步骤两次；

（7）将步骤（6）的洁净的EP管倒立放置在放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟；

（8）向步骤（7）的洁净的EP管中加入与全血同等体积的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。

采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，其优点是：

①本发明个步骤中涉及的离心时间、离心机转速，使全血中基因组DNA的提取过程具有高效、快速、简便的特点；

②本发明整个过程不需要使用有毒的苯酚的试剂，且所有试剂成本较低，使整个过程不仅安全可靠，而且比较经济；

②使用本发明方法纯化的基因组DNA完整性好，纯度高，可用于聚合酶链反应（PCR)、实时定量荧光聚合酶链反应(Real Time PCR)、芯片分析、分子克隆等分子生物学实验。

作为优选，本发明更进一步的技术方案是：

所述红细胞裂解液中各组分的配方为：

Tris-HCl (PH7.6或8.0)          0.01M

Sucrose                         320mM

MgCl₂                                                         5mM

Triton×100                     1%。

所述白细胞裂解液中各组分的配方为：