[发明专利]胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

权利要求书

1.一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗，其特征在于：该疫苗为ISCOM-DNA 复合物，每毫升中含有0. 1mg胆固醇、0. 1mg 卵磷脂、1mg QuilA和0. 5mg 质粒pStar-CPEB4 /BAFF。

2.一种如权利要求1所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆；

（2）肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆；

（3）重组载体pStar-CPEB4 /BAFF的构建：将CPEB4 全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游；

（4）pStar-CPEB4 /BAFF工程菌的构建：将CPEB4 原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4 工程菌；

（5）CPEB4 的诱导表达：用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度的CPEB4；

（6）ISCOM-DNA 复合物的制备。

3.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg -3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。

4.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacaga aagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

5.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（5）纯化的方法为：培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液透析脱盐，再用琼脂糖凝胶Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4 的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶Sephdex G-25柱脱盐。

6.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（6）0.1mg/ml胆固醇、0.1mg/ml 卵磷脂、1mg/ml QuilA和0.5mg/ml 质粒pStar-CPEB4 /BAFF ,反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰, 混合物经透析后形成微絮状物即ISCOM-DNA 复合物。

7.一种如权利要求1~6所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗在神经胶质瘤防治中的应用。