[发明专利]胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的免疫增强型疫苗，还涉及该疫苗的制备方法和用途。

背景技术

脑胶质瘤是人体中枢神经系统最常见的肿瘤，尽管采取了多种方法进行积极治疗，但是预后仍不够理想。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白( cytoplasmic polyadenylation element-binding proteins，CPEBs) 是一组介导mRNA 胞质多聚腺苷酸化和翻译的RNA 结合蛋白。近年来，人们发现其在大多数肿瘤细胞中有异常表达现象。随着CPEBs 与肿瘤关系的研究开展，国外已有研究报道CPEB4 在胶质母细胞瘤中呈阳性表达，并且其阳性率与肿瘤恶性程度的呈正相关。因此，CPEB4有望成为胶质瘤的一个新的治疗靶点。

BAFF 是B 细胞存活与成熟的必需因子,也被称为肿瘤坏死因子和凋亡配体相关的白细胞表达配体,为TNF 家族成员,是Ⅱ型跨膜蛋白,N 末端在胞内无信号肽,C 末端为胞外区,其中47～73 位氨基酸为跨膜区,74～285 位氨基酸为胞外区,133～285 位氨基酸为其发挥功能的主要区域,128～285 位氨基酸残基区域含有与受体结合的结构域。BAFF 有膜结合蛋白和可溶性配体(hsBAFF) 两种形式存在。hsBAFF 能够增强B 细胞、CD4 T 细胞、N K 细胞的活性, 使机体的免疫应答增强。BAFF 不仅是B 细胞的存活因子,还对T 细胞激活有共刺激作用。T 细胞和树突状细胞表达的BAFF 可作为T 细胞激活的共刺激因子,人重组或内源BAFF 刺激T 细胞分泌IFN-γ和IL-2 ,上调CD25 ( IL22 受体α链) 表达,并以IL-2 依赖方式促进T 细胞增生。

免疫刺激复合物( ISCOM) 是一种新型的蛋白质疫苗佐剂,可增强蛋白质抗原诱导体液和细胞免疫应答,包括抗体的产生、迟发性超敏反应、细胞毒性T 细胞的激活等。ISCOM 与裸DNA 混合制备DNA 疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力，明显高于单独使用裸DNA ,说明ISCOM 还具有增强DNA 疫苗免疫效果的作用。可能的机制是经ISCOM 包裹的DNA 能免受体内核酸酶的降解, 从而保证DNA 疫苗在鸡体内的持续表达。另外, ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内,有利于APC 吞噬ISCOM-DNA 复合物。ISCOM 具有制备简单、价格低廉等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备方法，以及基于此疫苗的应用，为胶质瘤的治疗提供新的治疗策略。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗为ISCOM-DNA 复合物，每毫升中含有0. 1mg胆固醇、0. 1mg 卵磷脂、1mg QuilA和0. 5mg 质粒pStar-CPEB4 /BAFF。

一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆

从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg -3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。

（2）肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆

提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

（3）重组载体pStar-CPEB4 /BAFF的构建

将CPEB4 全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。

（4）pStar-CPEB4 /BAFF工程菌的构建

将CPEB4 原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用SalⅠ酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4 工程菌。

（5）CPEB4 的诱导表达