[发明专利]一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法

权利要求书

1.一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为：pL281：

CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG；pS48：

GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC；pDGSL313-1：

CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT；pDGSL719-2：

TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT；其特征在于，包括如下步骤：

1）样品DNA提取：对四川各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；

2）按顺序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；

3）运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；

4）获得四川松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法的具体参数为，

1)样品DNA提取：取每个地区的鲜松茸样本菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性指套中捻碎；必须选择使用非过柱离心的可破碎细胞壁的商业DNA提取试剂盒提取新鲜样本的DNA；

2)按顺序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；其中，PCR的反应体系和检测条件：Premix Taq Version2.010μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM，DNA25-50ng，补ddH₂O至20μL，混合均匀后，94℃2min；94℃30sec，退火温度30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。退火温度：pL281/pS48引物体系64℃，pDGSL313-1/pS48引物体系64℃，pDGSL719-2/pS48引物体系68.5℃；

3）运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测：pDGSL719-2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-1/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹执行分辨率适度的OM500程序进行核酸分析；

4）获得四川省松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。

3.根据权利要求2所述的一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，按照该步骤即得到四川省甘孜藏族自治州稻城县日瓦乡亚丁村地区的松茸产地属性DNA指纹图谱。

4.根据权利要求2所述的一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法在步骤3）后还包括如下步骤：

a）单酶限制性酶切体系：10×QuickCut^TM Buffer1μL，QuickCut^TM EcoR V0.1μL，DNA25-50ng，补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min；

b）再次进行pL281/pS48的PCR反应体系：限制性酶切体系10μL，Premix Taq Version2.09.8μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM；

即得到四川省凉山彝族自治州西昌市磨盘乡、四川省甘孜藏族自治州乡城县尼斯乡、四川省甘孜藏族自治州得荣县奔都乡的松茸产地属性DNA指纹图谱。

5.根据权利要求2所述的一种四川省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法在步骤3）后还包括如下步骤：

a)混合酶限制性酶切体系：10×QuickCut^TM Buffer1μL，10×QuickCut^TM Buffer1μL，QuickCut^TM EcoR V0.1μL，QuickCut^TM Sph I0.1μL，DNA1μL，补ddH₂O至10μL，混合均匀后，37℃10min；

b)再次进行pL281/pS48的PCR反应体系：限制性酶切体系10μL，Premix Taq Version2.09.8μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM；

即得到四川省凉山彝族族自治州木里藏族自治县的松茸产地属性DNA指纹图谱。