[发明专利]一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分析检测领域，涉及一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用。 

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是唯一分布五大洲的O IE A类传染病,我国ND疫情十分严重,仍然是养鸡业发展最直接的威胁^[1]，可对家禽生产造成严重损失^[2]。 

新城疫病毒(NDV)，是新城疫的病原，属禽副粘病毒1型（AMPV-1），有囊膜，基因组为单股负链RNA，大小约15kb，编码6种蛋白质，包括RNA聚合酶（L），血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN），融合蛋白（F），基质蛋白（M），磷蛋白（P）和核蛋白（N）。新城疫病毒分离株根据对鸡致病严重程度可分为三个主要致病型（毒力型）^[2]：Lentogenic株是低致病力型，可造成鸡轻微呼吸道或肠道感染；Mesogenic株是中等致病力型，主要引起呼吸系统疾病；Velogenic株是高致病力型，造成高死亡率，基于病理表现被进一步分为嗜神经或嗜内脏型。高毒力型NDV属于必须报告的O IE A类传染病，它的发生可导致检疫和贸易禁运。NDV只有一个血清型,但是分为2类:class I、class I I,绝大多数常见的都是class II,可分成I-IV10个基因型。class II与class I核酸差异较大。 

目前，用鸡胚进行病毒分离，然后用新城疫特异性抗体做血凝抑制试验代表病毒检测的参考标准^[3]。虽然病毒分离是一个敏感和特异性的方法，但由于NDV毒力差异大,低毒和无毒株普遍存在,加之弱毒疫苗的普遍使用,对分离毒株血凝抑制试验结果必须结合毒力鉴定才能确诊,一般需要数天才能完成^[1]。 

将荧光定量RT-PCR应用于新城疫病毒的检测已有报道。Mark G.Wise等^「2」建立了RRT-PCR技术检测鸟类临床标本新城疫病毒。检测采用单管水解探针，引物和探针根据M基因保守区序列设计，可检测到大约1000拷贝病毒基因组RNA和10EID₅₀病毒。Beate M.Crossley等^「7」建立了高通量的检测外来NDV的RRT-PCR方法。L.Mia Kim等^「8」建立了新城疫病毒L基因基础上的RRT-PCR技术，对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR是一个有力的补充。但目前尚未有有关新城疫病毒NP基因RRT–PCR检测的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于新城疫病毒class I检测的RT-PCR试剂盒。 

本发明的另一目的是提供该试剂盒的应用。 

本发明的又一目的是提供一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，包含：上游引物CNPIF：5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′（SEQ ID NO.1）,下游引物CNPIR：5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′（SEQ ID NO.2）,以及TaqMan探针CNPIP：5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′（SEQ ID NO.3）。 

所述的试剂盒还包含10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝/μL的NP基因阳性质粒作为标准品模板。 

所述的NP基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体，在其EcoR V位点插入序列如SEQ ID NO.4所示的NP基因所得 

所述的试剂盒还包含～TaqMan Universal PCR Master Mix Kit为美国ABI公司产品。 

本发明所述的试剂盒在实时荧光定量检测新城疫病毒class I中的应用。 

一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法，将标准品模板和待测样品DNA模板以及分别置于各自的反应体系中，并同时置入PCR仪进行扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果，其中