[发明专利]检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法

权利要求书

1.检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，该方法包括如下步骤： 

1）针对靶基因human GPC3,Gene ID:2719的4个转录本的共有序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,再合成相应dsDNA，将dsDNA插入载体构建4种GPC-3-miRNA重组质粒，并通过荧光定量PCR挑选出干扰效率最高的一种GPC-3-miRNA重组质粒； 

2）将上述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞，并对其进行筛选，得到稳定转染HepG2细胞; 

3）将上述稳定转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型； 

4）而后测定上述稳定转染HepG2细胞在人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型中生长情况。 

2.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，4种所述GPC-3-miRNA重组质粒分别为： 

p-CMV-GPC-3-miRNA-1、p-CMV-GPC-3-miRNA-2、p-CMV-GPC-3-miRNA-3和p-CMV-GPC-3-miRNA-4; 

p-CMV-GPC-3-miRNA-1插入序列正、反义链（5’-3’）分别为 

F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3 

R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3 

p-CMV-GPC-3-miRNA-2插入序列正、反义链（5’-3’）分别为 

F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3 

R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3 

p-CMV-GPC-3-miRNA-3插入序列正、反义链（5’-3’）分别为 

F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3 

R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3 

p-CMV-GPC-3-miRNA-4插入序列正、反义链（5’-3’）分别为 

F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3 

R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3 。 

3.根据权利要求2所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述干扰效率最高的GPC-3-miRNA重组质粒为p-CMV-GPC-3-miRNA-1。 

4.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述载体为pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR。 

5.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法， 

所述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞中使用Genjet^TM转染试剂，所述得到稳定转染HepG2细胞使用的筛选用试剂为杀稻瘟菌素。 

6.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述步骤（3）中转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型的方法为：收集对数生长期的转染HepG2细胞，以2×10⁷／(0.2ml·只)接种于裸鼠右肩胛部皮下，形成直径4mm左右的皮下隆起。