[发明专利]检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及GPC-3相关基因技术，特别涉及一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)作为一种细胞表面蛋白，在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中特异性高表达，被认为是肝癌早期诊断及特异性治疗的潜在靶点。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）属于糖基磷脂酰肌醇锚定的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族。GPC-3基因定位于人染色体X26.10，因为该分子的突变或者异常表达常与疾病相关，所以受到广泛关注。现有技术当中，基于沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤研究没有简单高效的手段，沉默GPC-3基因转录对肝癌裸鼠移植瘤的能力的验证不够简便。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，方法包括如下步骤：

1）针对靶基因human GPC3,Gene ID:2719的4个转录本的共有序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,再合成相应dsDNA，将dsDNA插入载体构建4种GPC-3-miRNA重组质粒，并通过荧光定量PCR挑选出干扰效率最高的一种GPC-3-miRNA重组质粒；

2）将上述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞，并对其进行筛选，得到稳定转染HepG2细胞;

3）将上述稳定转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型；

4）而后测定上述稳定转染HepG2细胞在人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型中生长情况。

在一些实施方式中，4种的GPC-3-miRNA重组质粒分别为：

p-CMV-GPC-3-miRNA-1；

p-CMV-GPC-3-miRNA-2；

p-CMV-GPC-3-miRNA-3；

p-CMV-GPC-3-miRNA-4;

p-CMV-GPC-3-miRNA-1插入序列正、反义链（5’-3’）分别为

F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3

R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3

p-CMV-GPC-3-miRNA-2插入序列正、反义链（5’-3’）分别为

F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3

R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3

p-CMV-GPC-3-miRNA-3插入序列正、反义链（5’-3’）分别为

F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3

R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3

p-CMV-GPC-3-miRNA-4插入序列正、反义链（5’-3’）分别为

F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3

R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3

在一些实施方式中，干扰效率最高的重组质粒为：

p-CMV-GPC-3-miRNA-1。

在一些实施方式中，载体为pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR。

在一些实施方式中，干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞中使用GenjetTM转染试剂，得到稳定转染HepG2细胞使用的筛选用试剂为杀稻瘟菌素。