[发明专利]一种乳铁蛋白及乳过氧化物酶的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化，具体地说，涉及一种乳铁蛋白及乳过氧化物酶的纯化方法。

背景技术

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种非血红素铁结合蛋白，是转铁蛋白家族的一员，它与血清转铁蛋白、卵铁传递蛋白等均有将铁元素传递到血清的功能。除此以外，乳铁蛋白还具以下重要生理功能：（1）参与机体铁代谢，促进铁的吸收和利用，提高铁剂生物药的效果并减少其副作用，预防和治疗缺铁所导致的贫血性疾病；（2）广谱的抗细菌活性和抗病毒活性；（3）改善胃肠道功能，促进婴幼儿胃肠道发育；（4）抗炎症活性和免疫调节功能；（5）抗氧化功能：乳铁蛋白能通过清除体内过多的铁离子，阻止活性氧自由基形成和机体氧化反应，从而延缓衰老和预防慢性疾病；（6）乳铁蛋白还具有抗肿瘤、同多种抗生素和抗病毒药物协同作用。其中，乳铁蛋白的抗菌活性基于两种机理，第一是它可以剥夺细菌中的铁离子，从而抑制细菌活性；另一个机理是乳铁蛋白直接作用于受感染部位，它所带的正电荷可以与一些细菌、病毒、真菌和寄生虫表面的阴离子分子相互作用，最终导致细胞裂解。

人乳铁蛋白（Human Lactoferrin，HLF）是人乳中重要的免疫功能因子，其含量和生物活性均优于其它哺乳动物，因此国内外学者专家对于人乳铁蛋白的研究较多，分别利用转基因技术在不同表达体系中生产重组人乳铁蛋白，如：重组人乳铁蛋白分别在曲霉属真菌、转基因动物、转基因植物中均有表达，但相对而言，转基因动物如奶牛和奶山羊表达的重组人乳铁蛋白的产量和生物活性均优于其它表达系统，可以大规模生产重组人乳铁蛋白，从而开发以其为主要功能成分的能够治疗缺铁性贫血、抗菌、抗骨质疏松和抗肿瘤等药物。

乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LP）是分泌在乳中的一种氧化还原酶，它具有参与构成宿主对抗入侵微生物的天然防御系统，同时还具有抗菌活性、降解各种致癌物质及保护细胞过氧化的作用。LP可与过氧化氢、卤化物或类卤化物(X-、SCN-)一起构成乳过氧化物酶体系(LPS)。LP催化氧化卤化物形成次卤酸，产物次卤酸是一种细胞毒素，能与蛋白质交联，抑制酶和细胞因子的活性，因此LP也具有抑菌的功能。

目前，分离纯化乳铁蛋白与乳过氧化物酶的方法主要有离子交换色谱法、疏水互作色谱法、亲和色谱法、金属螯合色谱法、羟基磷灰石色谱法和超滤法。由于离子交换色谱具有低成本、耐酸碱、上样体积大、较易精确控制条件，适合放大进行工业化生产，而乳铁蛋白为带有正电荷的碱性蛋白，因此利用离子交换色谱进行分离纯化为首选，虽然离子交换技术有如上许多优点，但即便是用最精确的控制条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其它的纯化步骤。亲和色谱的特异性最佳、纯度较高、蛋白生物活性没有损失，但由于成本高，因此工业化难度较大。疏水互作色谱需要配置高浓度盐溶液来稀释蛋白溶液，因此可能会产生蛋白质沉淀现象而造成蛋白质的损失，且分辨率差、蛋白纯度较低。金属螯合色谱的原理是基于蛋白质与固定金属的亲和作用进行分离，且最常用于纯化带有多聚组氨酸标签的蛋白质，因此不适合用于乳铁蛋白的规模性纯化。羟基磷灰石色谱为六棱柱形HAp陶瓷构成，可以强力结合天然蛋白，一旦蛋白发生变性，这种结合力迅速降低，所以，在这种支持介质上蛋白质的保留程度不易预测。