[发明专利]一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用

说明书

技术领域

 本发明属于组织工程领域，具体涉及一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

生物支架材料是组织工程学中一个非常重要的组成部分，它不仅是细胞和生物活性因子进入机体的载体，而且还可以支持细胞在体内的增殖和分化及分泌活性细胞因子。理想的脂肪组织工程支架应具有：①适于细胞粘附、增殖和分化的三维空间结构；②具有良好的机械力学性能，不仅与宿主软组织特性相匹配，还要能够抵抗软组织的压力支持种子细胞的生长发育；③具备良好组成成分，对组织无毒、无副作用、无免疫原性；④具有特殊的生物刺激作用，如促进细胞的增殖分化，促进血管生成,促进宿主干细胞的迁移和分化等。存在于细胞间的纤维状和球形蛋白质的网状系统称之为细胞外基质（ECM），ECM是细胞环境的一种重要组成部分，细胞分泌的各种ECM成分形成基质间质和基质膜，在体内细胞锚定在该构架上。这些结构提供了组织特异性组织学的机体形成和发展所需要的空间定位和稳定性。细胞外基质(ECM)包括胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白,通过维持细胞存活、决定细胞形状、调节细胞增殖、控制细胞分化并参与细胞迁移来保持组织功能正常，维持新陈代谢旺盛，从而保持机体的年轻状态。成纤维细胞参与了多种细胞外基质成分分泌的过程，包括胶原蛋白、粘连蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素及弹性蛋白等的分泌调控。但是单纯使用细胞外基质(ECM)作为组织工程修复材料具有机械力学性能差，不能有效的抵抗软组织的压力等缺点。

目前国内外学者对碳酸钙在骨科组织工程方面进行了深入的研究：碳酸钙作为骨科组织工程材料，与传统的金属材料制品相比具有以下特点：①研究表明在碳酸钙结晶过程中添加特定的氨基酸和磷蛋白，可以生成球霰石(Vaterite)结晶。这种具有粗糙表面的微米级球形颗粒在体外实验中被证实有促进形成羟基磷灰石形成的作用；②较好的力学性能；③压电特性：碳酸钙材料受压后会产生电压，刺激刺激骨细胞的生长，促进骨愈合。但是单独的碳酸钙微球材料具有生物相容性差，难降解性以及亲水性差的缺点，不利于骨髓间充质干细胞的黏附以及生长。

发明内容

本发明的发明目的在于克服现有细胞外基质材料以及碳酸钙微球材料的不足，公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法。

本发明另一个目的在于公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。

本发明还有一个目的在于公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的应用。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法，包括如下步骤：

S1. 分别配制浓度为10mM~250mM钙盐水溶液和10mM~250mM碳酸盐水溶液；

S2. 将步骤S1制得的钙盐水溶液和碳酸盐水溶液搅拌混合、静置10min~90min，将沉淀过滤、洗涤、干燥即得碳酸钙微球；

S3. 将S2得到的碳酸钙微球60mg-70mg平铺在细胞培养容器中，用培养基浸泡，然后接种骨髓间充质干细胞，于CO₂培养箱中培养5~10天，每隔2~3天更换培养基，接着进行脱细胞处理，最后干燥即可得到碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。

优选地，步骤S2中所述搅拌混合的搅拌速度为100rpm/min~5000rpm/min。

优选地，步骤S2中所述钙盐水溶液和碳酸盐水溶液混合时钙离子和碳酸根离子的摩尔比为1:1。

优选地，所述钙盐为氯化钙、硝酸钙等可溶钙盐；所述碳酸盐为碳酸钠、碳酸钾等可溶碳酸盐。

优选地，步骤S2中所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥时间为24~72小时。

优选地，步骤S3中所述培养基中含有浓度为20~30mM的抗坏血酸。

步骤S3中接种骨髓间充质干细胞的密度为10000~30000/cm²，所述骨髓间充质干细胞为人源P3代骨髓间充质干细胞。

步骤S3中所述脱细胞的步骤为：将细胞培养容器放入-80℃冰箱冷冻5~10min，接着取出解冻，用去离子水冲洗细胞培养容器表面，循环操作2~6次。

优选地，所述解冻为室温解冻。

一种根据本发明碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。

本发明制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料在组织工程领域中的应用。

本发明制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料在间充质干细胞体外培养中的应用。