[发明专利]一种4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体的是一种4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的制备方法。

背景技术

有机磷农药属有机磷酸酯类的一组化合物，是目前广泛应用于防治粮、棉、水果及蔬菜虫害的农药。对人畜具有毒性，在生产和使用过程中不注意防护，可引起中毒。虽然与已禁用的有机氯农药相比其在环境中降解快，残毒低，但由于使用量大，加上违章非正常操作，不仅粮食、蔬菜农药残留问题日渐突出，在生产和使用这些农药的过程中残留的农药会将污染延伸到环境水体中，对地表水、地下水造成污染。目前有机磷农药残留检测方法主要有两大类——色谱检测法和快速检测法。色谱检测法是目前农药残留主要的检测方法，包括气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法。其特点是检测时间稍长，但检测精度高，可为农药残留执法提供依据。农药残留快速检测法是一类快速检测农药残留的方法，包括免疫分析技术、酶抑制法等。

有机磷的免疫法检测不仅方法简便，成本低廉，而且灵敏度高。但建立高效的免疫法检测需要高品质的抗原和抗体。但是，有机磷类化合物均是小分子，不具备免疫原性，不能直接产生抗体。因此，需要一种简单可靠的方法，合成一种能够激发动物产生抗体的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于有机磷抗体制备和免疫学检测的完全抗原。

本发明是在分析了大量常用的有机磷农药结构的情况下，应用4-氨基苄基磷酸二乙酯（DAP）作为半抗原，制备完全抗原。其特点是具备大部分有机磷的共同结构，并且结构相对复杂。采用戊二醛作为桥联剂，将4-氨基苄基磷酸二乙酯（DAP）通过五个碳的桥与载体蛋白连接，从而使半抗原完全暴露在载体蛋白的表面，有利于抗体的识别，免疫原性得到增强，有利于动物产生抗体。

本发明提供的技术方案是：

一种4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的制备方法，包括以下步骤：

（1）将4-氨基苄基磷酸二乙酯溶于去离子水制备抗原溶液，戊二醛溶于去离子水制备桥联剂溶液，载体蛋白溶于pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液制备载体蛋白溶液；

（2）将载体蛋白溶液和桥联剂溶液混合并4℃避光搅拌30分钟；

（3）用0.01M磷酸盐缓冲液透析或者超滤除去载体蛋白溶液和桥联剂溶液混合液中游离的桥联剂，得到活化后的载体蛋白溶液；

（4）抗原溶液缓慢滴入活化后的载体蛋白溶液中，4℃搅拌20小时以上，经透析、脱盐或者超滤除去游离抗原，得偶联物；

（5）加NaBH₄溶液还原偶联物。

进一步，步骤（1）中，所述载体为含有游离氨基的蛋白大分子。

进一步，所述的蛋白大分子为牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙种球蛋白或者钥孔血蓝蛋白。

进一步，所述步骤（1）中，所述抗原溶液浓度为10mmol/L，载体蛋白溶液浓度为0.5mmol/L，桥联剂溶液浓度为50mmol/L。

进一步，所述步骤（2）中按照血管紧张素与载体蛋白摩尔比10-20:1的比例。

采用紫外分光光度计对载体蛋白、未偶联小分子、偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在偶联物和载体蛋白对照浓度相同的情况下，如果偶联物的特征峰与载体蛋白特征峰及实验对照组特征峰相比发生明显偏移，说明偶联成功。

实验对照组按照上述步骤（1）-（5）制备，只是不添加抗原溶液。

戊二醛法原理：戊二醛是一种常用交联剂，两端的醛基均可与伯氨基缩合。本方法就是利用其交联剂的特性，将4-氨基苄基磷酸二乙酯（DAP）的氨基及载体蛋白中的伯氨基交联在一起。本发明的优点是提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于4-氨基苄基磷酸二乙酯抗体制备和免疫学检测的完全抗原，直接应用于免疫检测。

附图说明：

图1是偶联物通过分光光度计扫描鉴定图

具体实施方式：

实施例1  4-氨基苄基磷酸二乙酯与载体蛋白BSA偶联

（1）将4-氨基苄基磷酸二乙酯溶于去离子水制备抗原溶液，载体蛋白BSA溶于去离子水制备载体蛋白溶液，戊二醛溶于去离子水制备催化溶液，4-氨基苄基磷酸二乙酯抗原溶液为10mmol/L（即3.37mg/ml），载体蛋白BSA溶液为0.5mmol/L（即33mg/ml）B，戊二醛溶液为20mmol/L（即3.82mg/ml）；

（2）将戊二醛溶液和载体蛋白BSA4℃避光搅拌30分钟，4-氨基苄基磷酸二乙酯与载体蛋白BSA的摩尔比为20：1；