[发明专利]配基修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法

权利要求书

1.配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，其特征在于配基为DEAE或PEIS配基，步骤如下：

1）合成无孔单分散微球介质PGMA，并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL；

2）通过亲核反应配基修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上，制备得到配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE或PGMA-PEIL-PEIS；

3）将上述步骤2）中的配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中，然后加入变性蛋白液复性；

4）复性完成后，离心收集上清液，获得复性蛋白质溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3）复性缓冲液为：20～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1～3mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0～0.1mol/L NaCl及0～2mol/L尿素的混合物；pH值为7.5～9.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3）同电荷蛋白质为与配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中，PGMA-PEIL-DEAE的制备方法是：称取1.0～5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入5～25mL浓度为0.1～1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烷盐酸盐溶液以及等体积的浓度为3.5mol/L的NaOH溶液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50～100g/L；上述体系置于50～60℃、50～170rpm条件下反应1～2h；冷却后，将微球介质用去离子水，在转速为5000～8000rpm的条件下反复离心水洗，直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中，PGMA-PEIL-PEIS的制备方法是：称取1.0～5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入10～50mL戊二醛体积分数为10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50～100g/L，于25～30℃、50～170rpm的条件下反应4～6h；反应结束后，将微球介质用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下反复离心水洗，直至将游离的戊二醛清洗干净；随后，将微球介质移入10～50mL含有50～200g/L PEIS的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50～100g/L，于25～30℃、50～170rpm条件下反应48～60h；反应结束后，将微球介质用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下反复离心水洗，去除未反应的PEIS；接着，将微球介质移入10～50mL浓度为0.5mol/L的NaBH₄溶液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50～100g/L，于25～30℃、50～170rpm的条件下反应4～6h，以还原未反应醛基；最后用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下反复离心水洗，去除NaBH₄。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤4）方法是：将配基再修饰微球介质加入到由20～100mmol/L Tris–HCl、1～3mmol/L EDTA、0～0.1mol/L NaCl及0～2mol/L尿素组成，且pH值为7.5～9.0的复性缓冲液中，使最终复性体系中配基再修饰微球介质的浓度为20～150mg/mL；上述混合物置于温度为20～37℃的空气振荡器中振荡预平衡直至温度恒定；加入待复性的变性蛋白液，使复性体系中蛋白质浓度为1～4mg/mL；混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为50～170rpm条件下复性，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同。

7.权利要求1～6任意一项所述的方法，应用于复性过程中易发生聚集的蛋白质复性，所述的蛋白质包括含有二硫键蛋白质和不含二硫键的蛋白质。