[发明专利]配基修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的技术，属于生物技术领域中的蛋白质复性技术。

背景技术

基因工程技术的快速发展，为人类破译重大疾病、开发新型药物提供了重要技术支撑。目前，基因工程药物开发已逐渐进入成熟期，此类药物的生产必须借助适宜的重组基因表达系统。细菌表达系统因其具有表达量高、易于放大等优点，被广泛使用。但是利用该表达体系生产重组蛋白质时，往往由于目标蛋白质的表达量过高而在细胞内发生错误折叠及聚集，生成包涵体。包涵体不具有生物学活性，必须通过折叠复性以获得具有生物学活性的天然结构。在包涵体蛋白质的折叠复性过程中，变性蛋白质或折叠中间体间的疏水性相互作用极易引发蛋白质分子间聚集，因此抑制蛋白质聚集是促进复性的关键。

在复性过程中，通过加入低浓度盐酸胍和尿素、精氨酸、表面活性剂等小分子添加剂可以提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度，从而抑制蛋白质聚集(Molecular level insight into intra-solvent interaction effects on protein stability and aggregation.Advanced Drug Delivery Reviews,2011,63,1074-1085)。但是大多数添加剂在抑制蛋白质聚集同时也会抑制蛋白质分子的折叠，造成折叠速率的降低。

近年来色谱复性技术受到研究者的广泛关注。色谱复性分为凝胶过滤色谱复性，吸附色谱复性以及固定化辅助因子色谱复性等。色谱复性集成了蛋白质复性和色谱分离纯化技术，同时实现了目标蛋白质的复性和分离纯化。但色谱介质与蛋白质分子间的吸附作用会导致蛋白质分子折叠速率的降低。此外，色谱复性后的产品浓度较低。

为了克服小分子添加剂辅助复性和色谱复性技术的不足，近来有报道提出利用与复性蛋白质带有同种电荷的微球介质，如琼脂糖凝胶介质、经高分子量（平均分子量为60000）的聚乙烯亚胺PEI（将其命名为PEIL）一次修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球介质PGMA-PEIL等抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(Ion-exchange resins greatly facilitate refolding of like-charged proteins at high concentrations.Biotechnology and Bioengineering,2011,108,1068-1077;Ion-exchange resins facilitate like-charged protein refolding:Effects of porous solid phase properties.Journal of Chromatography A,2012,1225,168-173;Mono-sized microspheres modified with poly(ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactive and Functional Polymers,2012,72,889-896)。与传统的复性方法相比，同电荷微球介质促进蛋白质复性方法操作简单、介质回收方便且无需昂贵的大型设备。其中的琼脂糖凝胶介质比表面积较大，可被修饰为高电荷密度介质，但是其机械强度较差；相对于琼脂糖凝胶介质，无孔单分散PGMA-PEIL微球介质具有更好的机械强度，并可被修饰为超顺磁性微球从而大大简化分离操作，但是受到无孔微球介质较小的比表面积以及修饰方法本身的限制，PGMA-PEIL微球介质的电荷密度有限，限制了其辅助复性的效果。为了克服上述的缺陷，本发明提出了一种通过配基再修饰提高表面带环氧基团微球介质电荷密度的方法，相较一次修饰微球介质，该介质促进了蛋白质复性效果。该法不仅具有介质用量少、蛋白质复性收率高的特点，而且对高盐等环境具有更好的耐受性。

发明内容