[发明专利]一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株能实现烟草特有亚硝胺定向降解的短小芽孢杆菌，及其获取方法和在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。 

背景技术

TSNAs是烟草特有的N-亚硝基类化合物，是烟叶中重要的有害成分，对吸烟者的健康存在严重影响。NNN、NNK、NAB、NAT是烟草和烟气中主要的TSNAs，尤其NNN与NNK均为动物强致癌物，危害极大。影响烟草中TSNAs含量的因素很多，其中主要有烟草类型、烟草组织、栽培方式、调制方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸还原酶及亚硝化酶的活性等。通过这些影响因子的改变可以调控TSNAs的形成量，但目前关于TSNAs降解的方法还不多。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育一株抗逆性好，能实现烟草特有亚硝胺定向降解的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，选择适宜的施用方法，对于提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。 

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株能实现烟草特有亚硝胺定向降解的短小芽孢杆菌。本发明的第二目的在于提供所述短小芽孢杆菌的获取方法。本发明的第三目的在于提供所述短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。 

本发明的第一目的是这样实现的：一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，命名为05-5402，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的一个株系，是从烟株组织或植烟土壤中分离得到，已于2013年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.7418。 

本发明的第二目的是这样实现的：一种所述短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括： 

A、分离：将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25～35min，得到提取悬浊液，将提取悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株； 

培养条件为25～30℃，时间40～55h； 

分离培养基成分以g/L计为：琼脂12.0～18.0、K₂HPO₄1.4～1.8、KH₂PO₄0.3～0.5、NaCl0.08～0.12、MgSO₄·7H₂O0.1～0.3、CaCl₂0.04～0.06、MnSO₄·H2O0.001～0.003、CuSO₄·5H₂O0.0001、ZnSO₄·7H₂O0.0002、NaMoO₄·2H₂O0.0002、尼古丁0.8～1.2，pH6.5～7.5； 

B、筛选：将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株； 

培养条件为：25～30℃，时间40～55h； 

筛选培养基成分以g/L计为：琼脂12.0～18.0、K₂HPO₄1.4～1.8、KH₂PO₄0.3～0.5、NaCl0.08～0.12、MgSO₄·7H₂O0.1～0.3、CaCl₂0.04～0.06、MnSO₄·H2O0.001～0.003、CuSO₄·5H₂O0.0001、ZnSO₄·7H₂O0.0002、NaMoO₄·2H₂O0.0002、NNK0.8～1.2，pH6.5～7.5； 

C、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402； 

培养条件为：25～30℃，时间40～55h； 

纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、NaCl4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH7.0～7.5。