[发明专利]GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；

所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其特征在于：所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。

3.根据权利要求1所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其特征在于：所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。

4.权利要求1所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤：

1）获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段；

2）将步骤1）得到的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段连接于载体，构建含有GM-CSF基因或MART-1基因的重组载体；

3）获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段；

4）将步骤3）得到的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段连接于步骤2）得到的重组载体，构建所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体。

5.权利要求2所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤：

A）获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位点的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

B）构建pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体：用限制性内切酶EcoR I、BamH I分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤A）得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体；

C）获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段：从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物，其中的一种MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；

D）构建pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤B）得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体，将步骤C）得到的MART-1基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤A）所述的GM-CSF特异性引物为：

GM-CSF上游引物：5’-CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’，

GM-CSF下游引物：5’-TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’。