[发明专利]GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组载体及其制备方法和应用，特别是涉及一种双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

黑色素瘤（Melanoma），又称恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma，MM），是来源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤，多发生于皮肤体表，亦可见于脉络膜、软脑膜及消化道等，其恶性程度高，是体表肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。近年来，黑色素瘤的发病率及相应的死亡率在迅速增长，且发病年龄愈来愈早，严重威胁着人类的健康。

黑色素瘤的传统治疗，是包括手术、化疗、免疫治疗等在内的综合治疗。目前唯一有效的治疗方法是在肿瘤厚度小于1毫米时通过手术切除肿瘤，但由于黑色素瘤的高度侵袭转移性和对多种化疗药物的耐药性，导致其疗效不佳以及预后不良。针对肿瘤患者普遍存在免疫力低下的情况，通过免疫治疗来诱导机体的特异性抗肿瘤免疫反应，以抑制肿瘤的生长、转移及复发。近年来，携带外源特异性肿瘤抗原的疫苗已成为肿瘤免疫治疗的新方向，包括基因疫苗、肿瘤细胞疫苗、细菌疫苗、病毒疫苗及树突状细胞疫苗等。其中，基因疫苗是通过特定载体将具有治疗作用的基因导入细胞的治疗方法；然而，基因治疗只能短时间提高某种基因对应蛋白表达水平，其疗效持续时间短，缺乏长期抗肿瘤能力。

肿瘤之所以能在体内增殖、转移，是因为缺少MHC抗原等能激活T细胞的分子，因而不能被T细胞识别，无法激活T细胞介导的主动免疫。因此，要诱导强有力的抗肿瘤免疫应答，不仅需要肿瘤相关抗原的表达和呈递，还需要增强共刺激分子和细胞因子介导的免疫作用。

粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在T细胞免疫反应中起关键作用的DC细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进DC等APC分化、成熟和活化以及上调协同刺激分子（如CD86）的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和ADCC效应等活性，促进Th、Tc、NK细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。GM-CSF目前已被广泛应用于肿瘤的免疫治疗，GM-CSF以其显著的免疫调节作用和低毒性，成为肿瘤疫苗重要的免疫佐剂，GM-CSF还可作为化疗的辅助用药，提升肿瘤患者外周血白细胞水平（主要为粒细胞与单核细胞数量）的同时，诱导机体的免疫系统活化，加强对肿瘤的免疫；除上述生物学效应外，GM-CSF还能增加肿瘤基质分泌血管生成抑制素，抑制肿瘤的血管生成和转移；转染GM-CSF基因的肿瘤疫苗在黑色素瘤的免疫治疗研究中取得了显著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治疗方法只是局部地提高机体的GM-CSF蛋白表达水平，其免疫调节作用、抗肿瘤能力较小，而且缺乏免疫治疗的靶向性。

MART-1（人黑色素瘤分化抗原）是黑素瘤分化的相关抗原，其参与黑素小体成熟，表达于黑素瘤和黑素瘤细胞系，在多数类固醇肿瘤（包括肾上腺皮质肿瘤）、黑色素细胞病变以及血管周细胞瘤中表达。MART-1有较强的免疫原性，易于被细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别，产生有效的抗肿瘤免疫应答，被认为是黑素瘤免疫治疗的最佳候选者。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。

本发明的另一个目的是，提供所述GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法。

本发明的再一个目的是，提供所述GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体在黑色素瘤免疫治疗中的应用。

GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

在其中一个实施例中，所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。