[发明专利]G418抗性标记在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用

权利要求书

1.一种G418在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用，其特征是：以G418的抗性为木霉抗性筛选标记。

2.一种农杆菌介导的木霉遗传转化方法，包括

（1）将筛选标记基因与经过酶切并去磷酸化的载体p1300连接，构建成p1300-neo载体；

（2）将农杆菌用LB培养基活化并培养至OD₆₀₀值为0.3～0.6，收集菌体，并用15～25mmol/L CaCl₂重悬所述菌体，制备农杆菌感受态细胞；

（3）将步骤（1）中所述p1300-neo载体与步骤（2）所述农杆菌感受态细胞混匀，在35～40℃保温至少3min，再用LB培养基在25～35℃培养后，然后用含卡那霉素和利福平的YEB培养基培养并筛选出重组农杆菌并通过PCR确定含筛选标记基因；

（4）将处于对数生长期且OD₆₆₀值为0.6～0.8的活化的所述重组农杆菌菌液与木霉的分生孢子悬液混匀并诱导培养，再用M-100培养基在25～30℃培养并筛选出带有筛选标记基因的木霉，

其特征在于：所述筛选标记为G418抗性，所述筛选标记基因为从pSM334质粒中回收的G418抗性基因。

3.如权利要求2所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于：所述木霉分生孢子悬液是通过将木霉接种到PDA培养基，24～30℃光照培养木霉菌，再用无菌生理盐水洗下木霉分生孢子得到。

4.如权利要求2所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于：所述活化的重组农杆菌菌液是将所述目的农杆菌菌株接种到LB液体培养基中，29℃培养，再用诱导培养基29℃培养至OD₆₆₀达0.6～0.8得到。

5.如权利要求4所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于：所述诱导培养基中含乙酰丁香酮和葡萄糖和/或所述LB液体培养基中含卡那霉素和链霉素。

6.如权利要求2所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中的LB培养基中含有福利平和/或所述步骤（4）中M-100培养基中含头孢霉素。

7.一种农杆菌介导的木霉遗传转化体系，其特征是：以从pSM334质粒中回收的G418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体p1300连接成的p1300-neo为载体。