[发明专利]G418抗性标记在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体来说涉及一种G418抗性标记在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用。

背景技术

木霉菌广泛存在于土壤环境中，是土壤微生物的重要类群，也见于植物残体及动物粪便上，在植物根围、叶围、种子及球茎等生态环境中也大量存在。自从上世纪30年代以来，这类有益微生物已广泛用于植物病害的生物防治、纤维素酶的生产、生物修复功能。木霉能够降解氰化物、农药、甲醛、柴油、酚类及吸附重金属等。

农杆菌介导的遗传转化法为木霉菌的遗传改良和功能基因研究提供了有效手段。在木霉菌的遗传转化体系中，最常用的选择标记基因是潮霉素抗性基因。通过潮霉素抗性标记可以筛选获得木霉突变体菌株，进一步进行木霉菌基因功能的研究，更好地发挥木霉在生物防治、环境修复以及工业产品生产中的应用。但在研究木霉基因功能时，往往需要对野生木霉进行基因敲除实验，在此基础上对敲除突变体进行基因功能互补验证实验。此时，仅仅有一种抗性选择标记往往不能满足要求，必须要有新的抗性选择标记才可以进行遗传转化子的筛选。长期以来，用于木霉菌遗传转化的选择性标记仅有潮霉素B抗性标记，缺乏其它有效的抗性选择标记。因此，扩展木霉菌显性筛选标记具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种G418在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用方法，该应用方法是以G418的抗性为木霉抗性筛选标记，以解决木霉菌遗传转化的选择性标记不足的问题。

本发明的第二个目的是提供一种新的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，以解决通常通过PEG介导的原生质体转化，步骤比较繁琐的问题。

实现上述第二个发明目的的技术方案为：所述农杆菌介导的木霉遗传转化方法包括

（1）将从pSM334质粒中回收的G418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体p1300连接，构建成p1300-neo载体；

（2）农杆菌菌株用LB培养基活化并培养至OD₆₀₀值为0.3～0.6，收集菌体，并用15～25mmol/L CaCl₂重悬菌体，制备农杆菌感受态细胞；

（3）将（1）中p1300-neo载体与（2）中农杆菌感受态细胞混匀，35～40℃保温至少3min，用LB培养基在25～35℃培养，再用含卡那霉素和利福平的YEB培养基培养并筛选出重组农杆菌并通过PCR确认含G418抗性基因；

（4）将处于对数生长期且OD₆₆₀值为0.6～0.8的活化的重组农杆菌菌液与木霉分生孢子悬液混匀并诱导培养，再用含G418的M-100培养基在25～30℃培养并筛选出抗G418的木霉。

该农杆菌介导的木霉遗传转化方法与现有农杆菌介导的木霉遗传转化方法的区别在于以G418的抗性为筛选标记。

其中，

构建p1300-neo载体时用XbaⅠ酶切质粒pSM334和载体p1300。

木霉分生孢子悬液通过将木霉菌株接种于PDA培养基，24～30℃光照培养木霉菌，用无菌生理盐水洗下木霉分生孢子得到。

活化的重组农杆菌菌液通过将农杆菌菌株接种到LB液体培养基中培养，再用诱导培养基培养农杆菌至OD₆₆₀达0.6～0.8得到。其中，LB液体培养基中可含卡那霉素和链霉素；诱导培养基中含乙酰丁香酮和葡萄糖。

步骤（2）中的LB培养基中还可以含有福利平；步骤（4）中M-100培养基中可含头孢霉素。

上述木霉为野生型深绿木霉。

本发明的第三个目的是提供一种农杆菌介导的木霉遗传转化体系，该体系与现有木霉遗传转化体系的区别在于：以从pSM334质粒中回收的G418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体p1300连接成的p1300-neo为载体。