[发明专利]一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法，该方法包括：通过改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析等现代生物分离技术，提高了纯化糜蛋白酶的效率，保持糜蛋白酶的效价稳定。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：以糜蛋白酶原为原料，依次经过多重结晶、活化、盐析、超滤、热原处理、透析、亲和层析、冻干等工序纯化得到糜蛋白酶。 

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述纯化工艺包括如下步骤： 

1)糜蛋白酶原溶解后，加入饱和硫酸铵溶液，过滤，收集滤饼；溶解滤饼，结晶，母液回收，收集滤饼；改变结晶条件，重复结晶3次； 

2)溶解滤饼，加磷酸盐缓冲液，加入活化剂活化； 

3)活化液调节pH值后加入固体硫酸铵进行盐析，静置过夜，过滤，收集滤饼； 

4)加入磷酸盐缓冲液搅拌调节pH值，超滤； 

5)超滤液加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液后，调节pH搅拌，离心，弃沉淀物； 

6)取上述滤液置于于透析袋中，透析4～6天； 

7)亲和层析，用2种洗脱液进行洗脱，最终收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，-20℃保存； 

8)调节pH值，装盘、冻干，得糜蛋白酶。 

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，为了减少蛋白活性的损失，溶解糜蛋白酶原和透析最好选用冰冷的纯化水，4℃效果最佳。 

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，改变条件多次结晶，尤其是母液回收的工艺优化，提高了纯化糜蛋白酶的效率，更好的保持了蛋白的活性。 

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于多重结晶中还应进行必要的母液回收，并且硫酸铵：母液=305g：1L，活化工序中每100mL待活化液中加入胰蛋白酶5mg，盐析工序中每升活化液中加入500g硫酸铵。 

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述亲和层析快胶柱包括：苯基-Sepharose2B FF，苯基-Sepharose4B FF，苯基-Sepharose6B FF，苯基-Sepharose CL-2B FF，苯基-Sepharose CL-4B FF，苯基-Sepharose CL-6B FF。 

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述亲和层析条件为：平衡液选用含0.5-3mol／L(NH₄)₂SO₄的0.01-0.3mol／L，PH3-8的NaAc-HAc缓冲液，流速控制在1～5mL／min左右，洗脱液选用0.5-3mol／L的(NH₄)₂SO₄溶液和不含(NH₄)₂SO₄平衡缓冲液。 

9.如权利要求1～7所述的方法，其特征在于：亲和层析纯化所得糜蛋白酶效价高达1500～1800iu／mg。