[发明专利]一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种应用多重结晶、活化、盐析、透析、亲和层析等纯化糜蛋白酶的方法。

背景技术

糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，分子量为42000道尔顿，用于肽链的酶解，专门水解肽键，属于肽链内切酶，水解产率很高，但其专一性小于胰蛋白酶。其固体状态较稳定，呈白色棒状结晶；而水溶液极不稳定，pH在5～8时，其活力最强，也最易失去活性。

糜蛋白酶为胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质，作用、用途与胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。一般用于手术后创口或创伤愈合、抗炎及防止局部积血、水肿、扭伤血肿、乳房手术后局部肿胀、鼻炎、中耳炎等。也可用于白内障摘除、松解睫状肌韧带，以减少膜破裂和视网膜损伤。此外，糜蛋白酶与胰蛋白酶或其他化学药剂共同治疗各种炎症具有协同作用，故常用于外科创伤及眼睛消肿治疗。

本发明人自2008年开始对糜蛋白酶的生产工艺进行试验研究，特别是在生产过程中，不断探索，通过改变条件的多重结晶，使糜蛋白酶效价高达1500～1800iu／mg，生产工艺稳定，质量可控。

发明内容

本发明提供了一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法，是为了解决糜蛋白酶提取工艺蛋白活性损失严重的缺点，通过改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析纯化糜蛋白酶，较好的保持蛋白活性。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种亲和层析纯化糜蛋白酶的方法，其特征在于：改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析等现代生物分离技术，将糜蛋白酶效价提高到1500～1800iu／mg，更好的保持了蛋白的活性。在发明技术方案中，其特征还在于所述提取工艺包括如下步骤：

1)多重结晶

1.1)结晶I

核对糜蛋白酶原重量，加糜蛋白酶原重量7倍(w／v)纯化水搅拌溶解，加入少许硫酸搅拌，调节pH值至2.5～3.5；按2倍糜蛋白酶原重量(w／v)加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5～5.5，置于25℃条件下，保温，过滤，收集滤饼；

1.2)结晶II

加滤饼重量3倍量(w／v)的纯化水溶解，调节pH值至2.5～3.5；加滤饼重量1倍量(w／v)饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5～5.5，置于25℃条件下，保温，过滤，收集滤饼；

1.3)结晶III

加滤饼重量3倍量(w／v)的纯化水溶解，调节pH值至2.5～3.5；加滤饼重量1倍量(w／v)饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5～5.5，置于25℃条件下，保温，过滤，收集滤饼，滤液作母液回收；

1.4)母液回收III

量取母液体积，调节pH值至2.5～3.5，按硫酸铵：母液=305g：1L的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解；

1.5)结晶IV

加滤饼重量3倍量(w／v)的纯化水溶解，调节pH值至2.5～3.5；加滤饼重量1倍量(w／v)饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5～5.5，置于25℃条件下，保温，过滤，收集滤饼，滤液作母液回收；

1.6)母液回收IV

量取母液体积，调节pH值至2.5～3.5，按硫酸铵：母液=305g：1L的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解；

2)活化

称量滤饼重量，加3倍量纯化水溶解，调节pH值至7.0～9.0；加入滤饼重量1倍量的(w／v)磷酸缓冲液，搅拌，调节pH值至7.0～9.0。加入胰蛋白酶活化，置于冰箱中，两天后调节pH值至7.0～9.0；

3)盐析

活化液调节pH值至3.0～5.0，加入固体硫酸铵，静置过夜，次日过滤，收集滤饼；

4)超滤

加入滤饼重量15倍量的(w／v)磷酸盐缓冲液，搅拌，调节pH值至7.0～9.0，待液体超滤，体积控制在3／10；

5)热原处理

5.1)取超滤液，按50：5：3的比例，先后加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液；

5.2)调节pH值至8.0～10.0，搅拌，离心，弃去沉淀物，取滤液，准备透析扎包；

6)透析工序

取滤液，透析液扎包，放入纯化水中，进行透析交换，透析4～6天；

7)亲和层析