[发明专利]一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全领域，涉及一种检测食品中大肠菌群数量的方法，特别涉及一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法。

背景技术

民以食为天，食以安为先，食品安全关系到消费者的身心健康与财产安全。食品中的致病微生物是引发食品安全问题的重要原因之一，而大肠菌群是作为食品安全一个很重要的微生物指标，检测食品中大肠菌群数是判断样品是否被人、畜粪便污染及污染程度的标志，可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，以及潜伏着食物中毒和流行病的威胁，是否对人体健康具有潜在的危险。所以各个国家都针对诸如肉、蛋、奶、饮料等各种食品中的大肠菌群数量制定了限定标准，并依法对各种食品的微生物含量进行抽查检测。例如我国规定每100g鲜禽产品不能超过10000MPN，100ml巴氏杀菌乳中不能超过90个。由于食品基质复杂，食品中微生物数量较少，目前对食品中大肠菌群数量的检测方法都要依赖于细菌培养，在培养的基础上检测，因此检测时间需要1-2天完成。如目前的国标培养法需要48个小时才能完成，美国进口3M大肠菌群测试片也需要24小时才能确认结果。对于讲究鲜活的食品来讲，检测时间过长，大大影响了食品的供应，同时也降低了鲜活食品的质量。因此急需一种快速的食品中大肠菌群数量的检测方法。

数字PCR是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR技术不同的是数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在现阶段的低丰度因子含量检测中，定量PCR、杂交等方法都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求（如定量PCR检测中Ct值大于33的情况下，其重复性和准确性就不是很高），而微滴式数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有的待检测片段从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及精确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法。

数字PCR方法在检测食品中大肠菌群数量中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法，具体可包括如下步骤：

（1）富集待测食品中的细菌，将富集物与DNA结合物共同孵育，获得PCR扩增模板；

所述DNA结合物为不能穿过完整的细胞膜（活细菌），但能与细胞膜受损（死细菌）后暴露出来的DNA结合的物质；

（2）配制PCR反应体系，进行数字PCR反应；所述PCR反应体系中含有步骤（1）获得的PCR扩增模板、大肠菌群通用引物对、荧光染料、dNTP和DNA聚合酶；

（3）根据步骤（2）数字PCR反应产生的荧光信号，计算得到所述待测食品中的大肠菌群数量。

在上述方法中，所述待测食品可为液体食品，也可为固体食品。如各种鲜活农产品及其加工食品、水以及饮料等。在本发明的一个实施例中，所述待测食品为奶，具体为牛奶，更加具体为生鲜牛乳或巴氏杀菌牛奶。

当所述待测食品为液体食品（如牛奶）时，上述方法的步骤（1）中，所述“富集待测食品中的细菌”可为将所述待测食品（如牛奶）离心，所得沉淀即为所述富集物（富集了待测食品中的细菌）。进一步，将所述待测食品（如牛奶）离心的转速可为14000g，时间可为5-10min（如10min），温度可为4℃。

在上述方法的步骤（1）中，将所述富集物与所述DNA结合物共同孵育的目的是为了让所述DNA结合物与死细菌的DNA结合，从而阻断死细菌DNA分子的PCR扩增，从而有效实现对活细菌的选择性扩增。

在上述方法中，所述大肠菌群通用引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，或者由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2。

在上述方法中，所述DNA结合物具体可为叠氮溴化丙锭（PMA）或叠氮溴化乙锭（EMA）。

在上述方法中，所述荧光染料具体可为SybGreen或EvaGreen。