[发明专利]表皮细胞的动态富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表皮细胞的动态富集方法，属于生物细胞技术领域。

背景技术

我国烧伤的发病率为总人口的2～10‰，每年发生烧伤者近千万人，需住院治疗的达数十万之多，而且，严重烧伤者死亡率很高。烧伤治愈后常遗留大量疤痕，对患者的外貌、体形以及功能、心理方面都会造成负面影响。其中，大面积烧伤造成严重的皮肤缺失，是导致患者死亡的一个重要因素，皮源的解决问题的关键。

为了克服皮源的问题，通常是采用尽早关闭烧伤创面的方法，烧伤创面的早期关闭不仅可以挽救患者生命，也是减轻疤痕的重要手段，现有的技术中主要是通过微粒皮技术、培养表皮细胞以及Recell技术来实现的。

（1）微粒皮技术需先从患者身下未烧伤部位取下健康的皮源，再将这有限的自体皮源使用物理方法进行分散成尽量小的微粒，然后回植到病人的创面上，这种技术可将皮片扩大10～20倍，但该方法采用物理方法将皮片粉碎，然后回植到创面上，移植的皮粒贴附率不高，因此，效果难以保证；

（2）培养表皮细胞的方法需等待的时间较长，且远期疗效不佳；

（3）Recell技术是在静态下通过胰酶将基底层表皮细胞进行消化，然后利用喷雾法将混悬在林格氏液中的液态表皮细胞喷洒在创面，使用该技术可将皮片扩大40～60倍，但缺陷在于，该方法需要消耗大量的高浓度消化酶，处理过程中会采用刮擦等物理方式取样，而刮擦等物理方法会因操作者的技术熟练程度有所不同，细胞会有一定的损害，通过Recell获取的细胞活力仅在70%左右，因此，表皮干细胞的实际获取量难以确认，同时，由于细胞是呈液态喷雾在受损皮肤表面，细胞发生流动，很难保证细胞在创伤面的均匀分布，由此烧伤创面的愈合也无法保证，需要多次喷雾才能最终实现烧伤创面的恢复，延长了治疗流程，且所用的整个喷雾套件目前仍以进口设备为主，单台的价格在1-2万之间，治疗成本相应的也大大提高。

有鉴于此，本发明人对怎么样充分利用有限皮源的问题进行深入研究，开发出一种表皮细胞的动态富集方法，本案由此产生。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种培养效率高、操作便捷、皮源利用率高的表皮细胞的动态富集方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

表皮细胞的动态富集方法，包括预处理、消化和配液，具体步骤为，

（1）预处理：取表皮，制成若干块表皮片；

（2）消化：取步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液；

（3）配液：将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液。

为实现更好的使用效果，上述技术方案的进一步设置如下：

步骤（1）中，所取的表皮为断层皮片，制得的每块表皮片的粒径在1-5mm。

步骤（2）中，每1-2cm²断层皮片添加4-6ml的消化酶，所述的消化酶中主要作用成分为胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05%；动态消化是在恒温条件下进行的，由交替进行的静置和动态两种状态组成，即先静置5-7分钟（也可称为静态消化），然后进入动态，动态保持3-7分钟后，再静置5-7分钟后，进入动态，温度控制在35-38℃，优选为36.8-37.5℃，静置-动态-静置-动态构成一个循环，每个动态消化过程包含2-5次该循环，动态消化完成后进行细胞冲刷。较优的，断层皮片的厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片；动态时确保消化容器内物质的转速为60-300rpm，优选转速为180-300rpm，细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。

在步骤（3）与步骤（2）之间，至少进行一次过滤，采用目数为20-60条件下进行过滤，去除表皮残渣，而下层的细胞液用于配液。较优的，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂优选为自体血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下层细胞液中自体血清的添加1-3滴（每15滴为1ml），大豆胰蛋白酶添加量为下层细胞液量的0.8-3倍。