[发明专利]一种利那洛肽的制备方法

权利要求书

1.一种利那洛肽的制备方法，包括如下步骤：

1）Fmoc-Tyr(tBu)-树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；

2）利那洛肽肽树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽肽树脂，其中1-6位的Cys侧链采用Hqm保护，2-10位的Cys侧链采用Trt保护，5-13位的Cys侧链采用Acm保护；

3）利那洛肽线性肽粗肽的制备：利那洛肽肽树脂经裂解反应，获得带有Acm保护基团及Hqm保护基团的线性肽粗肽；

4）利那洛肽2-10位第一对二硫键的形成：氧气氧化得到2-10位成环的第一对二硫键；

5）利那洛肽Hqm保护基团的脱除及1-6位第二对二硫键的形成：加入水合肼，脱除Hqm保护基团的同时形成第二对二硫键；

6）利那洛肽5-13位第三对二硫键的形成：加入碘和醋酸，形成第三对二硫键；

7）纯化和冻干后获得利那洛肽精肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1）中的载体树脂为Wang Resin，优选Wang Resin的替代度为0.2～1.2mmol/g，更优选为0.3～1.0mmol/g，最优选为0.6～0.8mmol/g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所用的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Hqm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。

4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤1）中的偶联体系为HOBt/DIC/DMAP，HOBt/DCC/DMAP，HOAt/DIC/DMAP，HBTU/HOBt/DIPEA，TBTU/HOBt/DIPEA，PyBOP/HOBt/DIPEA，优选为HOBt/DIC/DMAP或HBTU/HOBt/DIPEA。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤2）中逐一偶联的方式采用的偶联试剂为DIC+A或B+A+C，其中A为HOBt或HOAt；B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIPEA或TMP，优选为HOBt+DIC或HOBt+HBTU+DIPEA。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤3）中的裂解试剂为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷TIS、1,2-乙二硫醇EDT、苯酚PhOH和水组成的混合试剂，混合试剂中各组分的体积比优选为TFA:TIS:EDT:PhOH:H₂O=85-95:2-5:0-3:0-2:1-5，更加优选为TFA:TIS:EDT:PhOH:H₂O=90:3:2:1:4或TFA:EDT:H₂O=90:5:5，裂解时间优选为1.5-3.5小时。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤4）中2-10位形成第一对二硫键采用的是带Acm和Hqm保护基团肽的水溶液，溶液的浓度为0.1-2mg肽/ml，优选浓度为0.1-1mg肽/ml，用氨水调节pH为7.0，往其中通入氧气进行氧化，氧化时间为4小时。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤5）中选择性脱除Hqm保护基团同时形成1-6位第二对二硫键采用的是往上述水溶液中加入5%的水合肼，用醋酸和氨水调节pH=8.5，空气下氧化反应，反应时间为5-44小时，优选为10-24小时。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤6）中5-13位形成第三对二硫键采用的是往上述水溶液加入相当于肽的5-40倍当量的碘，优选10-30倍当量，然后加入水溶液体积20%的醋酸，氧化时间为0.2-1小时，优选为0.2-0.5小时。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤7）所述的纯化为反相高效液相色谱纯化。