[发明专利]一种利那洛肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种利那洛肽的制备方法。

背景技术

利那洛肽，英文名称为Linaclotide；商品名称为Linzess；中文通用名称为利那洛肽。其为一种GC-C（肠上皮细胞尿苷酸环化酶C）受体激动剂，2012年8月美国FDA批准用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症（IBS-C）。该药物由Ironwood制药公司开发，化合物结构为14个氨基酸组成的含有三对二硫键的多肽（三对二硫键分别为：1-6；2-10和5-13），可以通过细胞表达和化学合成制得，具体肽序如下式所示：

目前，针对利那洛肽尚没有比较高效的制备方法，也未见相关的已经授权的专利报道。有关其合成方法，只有Benitez等人2010年进行了相关的报道（参见Peptide Science,2011,96:69-80）。该文献中采用三种方法对利那洛肽进行尝试性合成。

方法一：采用Trt为Cys的侧链保护基团，用Fmoc固相肽合成方法完成线性肽的合成，得到粗肽后用液相氧化的方法一步氧化得到目标肽。

方法二：采用Trt和Acm为Cys侧链保护基团，Fmoc固相肽合成方法得到部分保护的线性肽，然后用半选择的策略完成二硫键的合成。

方法三：分别采用[2Mmt+2Acm+2Trt]、[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]、[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]三种完全选择性策略合成利那洛肽。

方法一中，虽然合成步骤简单，只使用了一种Cys的保护基团。但是，对于需要定位形成三对二硫键的肽来说，随机氧化会得到许多种不同的异构体，尽管可以通过一些缓冲溶液体系来使得氧化过程中尽可能大的转变为目标分子，但是始终无法避免其他异构体的产生。这种操作容易使得目标肽粗肽纯化困难，收率不高，很难进行大规模生产。同时，采用该方法进行氧化，对外界条件比如温度等的依赖性也非常高，在不同的环境下，自然氧化所得到的产品收率相差也非常大，不利于产品质量的控制。

方法二为一种半选择性定位氧化的方法，相对于方法一，定位氧化了一对二硫键，降低了形成不同异构体形成的数量，但是同样无法避免异构体的产生。同时，论文中也直接提到，采用碘氧化形成两对二硫键，粗肽收率将严重下降。

方法三中，研究者选择采用三种不同的完全选择性形成三对二硫键。第一组实验，[2Mmt+2Acm+2Trt]策略最终的结果是无法得到目标产物；[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]方法的结果同样非常不理想，最终失败；[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]方法，研究者最终还是没有得到目标产物，同时得出结论利那洛肽无法采用完全选择性形成三对二硫键。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种采用完全选择性形成三对二硫键合成利那洛肽的方法。使用本发明工艺，可以在同一个溶液体系中，依次完成利那洛肽中三对二硫键的形成，因此该工艺的操作方法相当简单，同时也大大提高利那洛肽最终精肽的收率，并且可以实现大规模生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种利那洛肽的制备方法，包括如下步骤：

1、Fmoc-Tyr(tBu)-树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；

2、利那洛肽肽树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽肽树脂，其中1-6位的Cys侧链采用Hqm保护，2-10位的Cys侧链采用Trt保护，5-13位的Cys侧链采用Acm保护；

3、利那洛肽线性肽粗肽的制备：利那洛肽肽树脂经裂解反应，获得带有Acm保护基团及Hqm保护基团的线性肽粗肽；

4、利那洛肽2-10位第一对二硫键的形成：氧气氧化得到2-10位成环的第一对二硫键；

5、利那洛肽Hqm保护基团的脱除及1-6位第二对二硫键的形成：加入水合肼，脱除Hqm保护基团的同时形成第二对二硫键；

6、利那洛肽5-13位第三对二硫键的形成：加入碘和醋酸，形成第三对二硫键；

7、纯化和冻干后获得利那洛肽精肽。

在本发明制备利那洛肽的方法中，步骤1中的载体树脂优选为Wang Resin。在进一步优选的实施方案中Wang Resin的替代度为0.2～1.2mmol/g，更加优选为0.3～1.0mmol/g，最优选为0.6～0.8mmol/g。