[发明专利]一种基因敲入重组载体及其制备方法和小鼠模型制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种小鼠模型制备方法及基因敲入重组载体。

背景技术

基因敲入(Knockin)是根据实验要求在目的基因位置引进特定的突变或外源基因的技术，例如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)；或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达并研究基因的表达谱。

IL17A（白介素-17A）是细胞因子IL-17家族成员之一，在宿主防御和炎症过程中起关键作用。

目前针对IL17A基因表达进行监测的模式小鼠是IL17A-GFP基因敲入小鼠模型，通过检测小鼠体内T细胞和小肠细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来分析IL17A基因的表达。此种模型只能通过可检测绿色荧光的小动物活体成像仪或处死小鼠后提取组织和细胞后用荧光显微镜观察才可检测，对实验仪器和设备要求较高，操作不够方便灵活，且荧光灵敏度低。因此有必要开发一种可通过体外检测分析IL17A基因表达情况的模型小鼠的制备方法。

Gluc（Gaussia luciferase）是分离于夏威夷水域的一种海洋桡脚类动物（Gaussia princeps）的新型荧光素酶。荧光素酶可以催化荧光素(luciferin)氧化成氧化荧光素（oxyluciferin），在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。通过报告基因载体，Gaussia luciferase可用于哺乳动物细胞表达，并可以分泌到细胞外。与其他荧光素酶相比，使用Gaussia luciferase作为报告基因有更多的优势：能分泌到细胞外、灵敏、稳定、无需ATP、分子量小，可通过检测实验动物血液和尿液中荧光素酶活性，间接监测体内的生理过程。与监测体内过程常用的分泌型报告基因SEAP（secreted alkaline phosphatase)相比，Gluc具有实验时间短，线性范围宽和灵敏度高等优点。

发明内容

本发明的目的是克服现有的用于检测IL17A基因表达的模式小鼠中存在的上述缺陷，获得可以通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而方便地对IL17A基因的表达情况进行检测的基因敲入模型小鼠及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于基因敲入的重组载体，其中，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-IRES-luc；

其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。

本发明还提供了一种重组载体的制备方法，其中，该方法包括将DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP中。

本发明还提供了一种可以简便的检测体内IL17A基因表达的小鼠模型的制备方法，该方法包括将本发明所提供的重组载体转染进C57BL/6胚胎干细胞中并筛选获得阳性重组胚胎干细胞，用所述阳性重组胚胎干细胞获得F1代杂合子小鼠，使雌雄F1代杂合子小鼠交配获得F2代小鼠，并在F2代小鼠中筛选出携带有所述重组载体的纯合子IL17A-luc模型小鼠。

本发明还提供了一种检测本发明所制备的小鼠模型中IL17A基因表达情况的方法，该方法包括对小鼠模型的血液和/或尿液中分泌型荧光素酶的含量进行检测。

本发明还提供了一种IL17A-luc模型小鼠在与IL17A基因表达相关的研究中的应用。

本发明还提供了一种IL17A-luc模型小鼠在筛选可诱导IL17A基因表达的药物中的应用。

本发明还提供了一种IL17A-luc模型小鼠在筛选可抑制IL17A基因表达的药物中的应用。

通过本发明所提供的方法所制备的基因敲入模型小鼠具有C57BL/6遗传背景，小鼠模型的建立过程中不需要进行多次的回交，缩短了模型建立的时间。

此外，利用本发明所提供方法制备的模型小鼠具备以下优点：（1）该模型小鼠能够用来方便地通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而对IL17A基因的表达情况进行检测；（2）不需要荧光显微镜等复杂设备；（3）分泌型荧光素酶是通过荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应而发光，不需要激发光，所以荧光背景远低于GFP荧光，且检测灵敏度更高，背景更干净，实验结果也更加准确。