[发明专利]植物重组几丁质酶蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种植物重组几丁质酶蛋白及其制备方法。

背景技术

几丁质酶存在于各种植物中，2002年，国外有人利用大白菜为研究对象，克隆出了大白菜几丁质基因片段118bp，后来国内学者利用克隆的办法克隆得到大白菜基因序列，但是对于基因编码的蛋白表达情况，至今未见报告，因此无法对其展开深入的研究。

发明内容

本发明的目的是针对目前植物中几丁质酶蛋白未见报告的缺陷，提供一种植物重组几丁质酶蛋白及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种植物重组几丁质酶蛋白，其特征在于：所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的是提供一种植物重组几丁质酶蛋白制备方法，包括如下步骤：

（1）植物重组几丁质酶基因的克隆及测序；

（2）表达载体的构建与鉴定；

（3）重组蛋白的融合表达；

（4）重组蛋白的鉴定；

（5）表达产物的可溶性分析；

（6）融合蛋白的纯化；

（7）植物重组蛋白的生物学活性检测。

进一步的：所述步骤（1）包括如下步骤：

步骤1、利用十字花科植物几丁质酶基因的保守序列涉及特异性引物，以白菜基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增出长度为1098bp的特异性DNA片段和长度150的几丁质酶基因5’端序列片段；

步骤2、利用不同浓度的水杨酸处理苗龄为5天的白菜植株，处理浓度为1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5mmol/L，以未处理的为对照组，分别在处理后8、112、16、20小时提取粗酶液并测定酶活力，选择其中酶活力最高的吹植株叶片提取叶片总RNA；

步骤3、利用Trizol试剂法提取提取经1 mmol/L水杨酸处理的白菜叶片总RNA，利用3’RACE技术扩增得到该几丁质酶基因全长1517bp序列；

步骤4、几丁质酶基因序列同源性比对和测序。

进一步的：所述步骤4中几丁质酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的有益技术效果是：本发明利用克隆方法得到植物几丁质酶基因的序列，同时利用体外表达的方法，首次得到了植物重组几丁质酶蛋白，为几丁质的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

植物重组几丁质酶蛋白的制备方法；

（1）植物重组几丁质酶基因的克隆及测序；

步骤1、利用十字花科植物几丁质酶基因的保守序列涉及特异性引物，以白菜基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增出长度为1098bp的特异性DNA片段和长度150的几丁质酶基因5’端序列片段；

步骤2、利用不同浓度的水杨酸处理苗龄为5天的白菜植株，处理浓度为1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5mmol/L，以未处理的为对照组，分别在处理后8、112、16、20小时提取粗酶液并测定酶活力，选择其中酶活力最高的吹植株叶片提取叶片总RNA；

步骤3、利用Trizol试剂法提取提取经1 mmol/L水杨酸处理的白菜叶片总RNA，利用3’RACE技术扩增得到该几丁质酶基因全长1517bp序列；

步骤4、几丁质酶基因序列同源性比对和测序。

（2）表达载体的构建与鉴定

在上下游引物5’分别添加EcoRI和XhoI 酶切位点（SEQID NO：3 5’-CGGAATTCAACATGGCTCTCACAAAATTA-3’, SEQID NO：4  5’-CGCTCGATTTTCTTTTAAATGGC-3’），以pMD19-T-几丁质酶为模板，扩增几丁质酶基因，回收扩增PCR产物割胶纯化，将纯化产物和空载体pGEX-6p-1分别用EcoRI和XhoI双酶切，回收纯化酶切产物，经T4连接酶连接转化克隆感受态细胞DH5α，涂布平板挑取单菌落与液体LB（Amp+）中摇菌，抽提质粒，将重组质粒进行双酶切鉴定，将酶切鉴定为阳性菌液送往上海生工进行基因测序，测序准确后，并将其命名为pGEX-6p-1-几丁质酶。

（3）、重组蛋白的融合表达