[发明专利]重组长链人胰岛素样生长因子-I的制备方法

说明书

本发明提供了一种重组长链人胰岛素样生长因子‑I的制备方法。具体地，本发明提供一种融合蛋白以及基于该融合蛋白的生产工艺，该工艺适合高效制备高纯度和高活性的重组人长链胰岛素样生长因子‑I(LR³IGF‑1)。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地来说，本发明涉及重组蛋白的表达和制备工艺，特别是利用基因重组技术制备重组人长链胰岛素样生长因子-I的制备方法。

背景技术

上世纪五十年代，Salmon和Daughaday发现有这么一类生物活性物质，它能促进软骨对硫的吸收，从而促进人体骨骼的生长，当时他们将之命名为“硫化因子”(SulphateFactor SF)。后来经进一步研究发现，该因子具有与胰岛素相类似的功能，如降血糖、降血脂的作用，所以又被冠名为“胰岛素样生长因子”(Insulin-like Growth Factors,IGFs)，该称谓就延用至今。

已知胰岛素样生长因子(IGFs)是由两类物质组成，即IGF-I和IGF-II。在人体内，IGF-I是主要部分，能分泌IGF-I的人体细胞有肝细胞、肾细胞、脾细胞等多达十几种。而IGF-II更多的是参与胚胎的发育，在人体内的重要性及功能的广泛性不及IGF-I。

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因位于12号染色体，编码分子量为7648的70个氨基酸组成的单链多肽，含三个二硫键。它的结构、生物学性质和化学性质与胰岛素有相似之处。有关研究证明IGF-I介导生长激素的作用而促进生物的生长，因此像骨骼生长、细胞复制和另外一些与生长相关的过程均受IGF-I水平的影响。现已证明IGF-I在人体内有极其重要并且丰富的生物学功能，如促生长、促分化、参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢等，与生长荷尔蒙的作用相类似，都是起非常作用的生长因子。

胰岛素样生长因子-I的生理浓度受甲状腺疾病、糖尿病和营养不良的影响。胰岛素样生长因子-I与另外一些生长因子有协同作用，如它可以促进软组织和间叶组织损伤的修复，也可以促进哺乳动物细胞在无血清培养基中的生长等。近年来胰岛素样生长因子-I在国外主要用于ALS(肌营养不良性脊髓侧索硬化症)、周围神经疾病、运动神经元疾病和脊髓灰质炎后综合症。

Cephalon公司的基因工程产品重组胰岛素样生长因子-I已获得美国FDA批准，投入市场，用于治疗原发性IGF-I缺陷引起的侏儒症。另有Pharmcia用之于生长激素受体缺乏症(GHRD)的治疗和生长迟缓抗体阳性GH缺乏症LA的治疗也已进入三期临床工作。此外Genentech公司用于糖尿病的治疗和Chiron公司用于肾衰的治疗也都进入了二期临床实验阶段。

此外，国内外也在开发人胰岛素样生长因子的衍生物及类似物。其中Gropep公司是其中的典型代表，该公司的美国专利US5679771A公开了一系列特定的长链胰岛素样生长因子，其中长链人胰岛素样生长因子LR³IGF-1是由83个氨基酸残基组成的人胰岛素样生长因子衍生物。该LR³IGF-1是由人胰岛素样生长因子序列上将第三位的氨基酸残基Glu取代为Arg并在IGF1的N末端添加13个氨基酸而形成的多肽。在专利US5679771A中，Gropep公司称这种IGF1的衍生物能保持人胰岛素样生长因子的生物学活性，促进细胞和组织生长增殖，有利于提高基因工程细胞的蛋白表达水平。

目前LR³IGF-1已经在抗体药物生产工艺中细胞表达中得到广泛的应用，然而，目前的生产工艺尚难以令人满意，不适合大规模生产。例如对于常用的酵母细胞分泌表达而言，酵母细胞生产周期较长，产量不高，纯化难度大且在发酵过程中有降解产物出现。此外，大肠杆菌分泌表达的表达量低，提取劳动强度大，成本太高，难以大量制备高纯度和高活性的LR³IGF-1。

因此，本领域迫切需要开发能够高效生产高纯度LR³IGF-1的工艺，以便进行大规模生产。

发明内容