[发明专利]一种水母溶血毒素粗提物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种水母溶血毒素粗提物的制备方法。 

背景技术

水母毒素是一类毒性强烈的肽类毒素，具有心血管、溶血、神经、肝脏、皮肤与肌肉、蛋白酶等多重生物活性，是导致水母蜇伤系列症状的主要原因。 

溶血毒素是水母毒素的重要组分，是研究报道最多的一类水母毒素，其丰度较高，在水母捕食、防御过程中发挥重要作用，具有较高的研究价值。 

由于水母毒素具有热不稳定、易粘附等特点，加之用于分离纯化的毒素粗提物制备方法的局限性，水母溶血毒素成分的纯化和鉴定工作进展较慢，总体上滞后于其他常见有毒生物溶血毒素。 

水母毒素粗提物制备主要有两种方法：一种是以水母口腕部组织（触手、口腕的混合物）为原料，利用水母组织易自溶的特点，低温（4℃）下搅拌自溶3-4天，离心收集上清经透析即为毒素粗提物（Xiao L,He Q,Guo Y,et al.,Cyanea capillata tentacle-only extract as a potential alternative of nematocyst venom:Its cardiovascular toxicity and tolerance to isolation and purification procedures[J].Toxicon.2009,53(1):146–152）；另一种是切取水母触手、口腕或整个口腕部组织，低温自溶3-4天后，离心收集沉淀，洗涤沉淀并收集其中的刺丝囊，再通过超声或研磨破碎刺丝囊，离心收集上清经透析后为毒素粗提物样品（Marino A,Crupi R,Rizzo G,Morabito R,Musci G,La Spada G.2007.The unusual toxicity and stability properties of crude venom from isolatednematocysts of Pelagia noctiluca(Cnidaria,Scyphozoa).Cell Mol Biol(Noisy-le-grand).53Suppl:OL994-1002.）。 

综上所述，这两种方法均需经过组织自溶，耗时较长。前者操作相对简易，但必然引入大量非毒素类组织蛋白；后者所制毒素粗提物较前者纯净，但操作环节较多，期间刺丝囊发射率高、损耗大，所获毒素蛋白量很小。总的来说，这两种制备水母毒素粗提物的方法均存在局限性，难以满足后续毒 素组分离纯化的需要。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便、耗时较短、杂质较少且活性更强的水母溶血毒素粗提物的制备方法。 

本发明的主要技术方案是：以鲜活水母口腕（不含触手）为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母溶血毒素的方法。 

本发明提供了一种水母溶血毒素粗提物的制备方法，包括以下步骤：A、以鲜活水母不含触手的口腕组织为原料，加入PBS（Phosphate Buffer Solution，磷酸盐缓冲液）清洗； 

B、振荡：加入与步骤A的口腕组织等体积的PBS，在涡旋振荡器上以转速2000-3200rpm，最优为3200rpm，振荡1-5min，最优为2min； 

C、过滤：步骤B得到的内容物以100-500目，最优为300目筛网过滤，收集滤液； 

D、透析：步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4℃下用预冷的PBS透析6-24h，最优为8h，然后4℃下3000-10000×g离心10-30min，最优为10000×g离心10min，收集上清液，即得水母溶血毒素粗提物。 

所述的步骤A中，挑选有活力、口腕发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态；分离不含触手的口腕组织，剪取口腕组织，分装到离心管中。 

所述的步骤A中，加入与口腕组织等体积的PBS，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。 

上述步骤中，PBS缓冲液是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution）。 

上述步骤中，预冷的PBS缓冲液中的预冷为常规技术，最优的为：使用的PBS缓冲液需经过孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。 

本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少且不含心血管活性，而溶血活性更强，有利于溶血组分的进一步纯化。