[发明专利]检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用有效

申请号：	201310628630.9	申请日：	2013-11-29
公开（公告）号：	CN103695561A	公开（公告）日：	2014-04-02
发明（设计）人：	陈金顶;毛晶丹;邓洁汝;勾红潮;裴晶晶;姚俊庸;叶佐东	申请（专利权）人：	华南农业大学
主分类号：	C12Q1/70	分类号：	C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
代理公司：	广州市华学知识产权代理有限公司 44245	代理人：	苏运贞;杨晓松
地址：	510642 广***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	检测日本脑炎病毒 rt lamp 核酸试纸试剂盒应用
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【权利要求书】：

1.一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条：

所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

F3：5’-CGGCATGGAGAAACAGAGAA-3’；

B3:5’-CCTTCAGAGCCAGTTTGTCC-3’；

FIP:5’-Biotin-CCTGCCAACGCTTGATGGAGGGAAGAGGCACATGCCACAA-3’；

BIP:5’-AGCCATCGTGGTGGAGTACTCGAGCCTGCATTTCAGGTGAC-3’；

LoopF：5’-FITC-GACCCAAGAGCTACGACAGACTGTT-3’；

LoopB：5’-GCTCGGTGAAGTTGACATCAG-3’。

2.根据权利要求1所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

3.根据权利要求2所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和权利要求1所述的引物组；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

4.根据权利要求1所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：还包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱溶液和AMV逆转录酶。

5.根据权利要求4所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含浓度为5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的引物LoopF和浓度为10μmol/L的引物LoopB。

6.权利要求1～5任一项所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤：

（1）配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为10⁵U/L、10倍反应缓冲液为1倍、链置换DNA聚合酶为0.32U/L、dNTP混合物为0.4～0.6mmol/L、甜菜碱为0～2mol/L、MgSO₄为0～3mmol/L、FIP引物为1.6μmol/L、BIP引物为1.6μmol/L、F3引物为0.2μmol/L、B3引物为0.2μmol/L、LoopF引物为0.8μmol/L、LoopB引物为0.8μmol/L，待测样品RNA为12ng/μL；恒温反应；

（2）反应：将步骤（1）恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10min观察结果；

（3）结果判读：直接肉眼判读；

①阴性：仅在质控区出现一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有日本乙型脑炎病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为日本乙型脑炎病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

7.根据权利要求6所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：

步骤（1）中所述的dNTP混合物的终浓度为0.4mmol/L；

步骤（1）中所述的甜菜碱的终浓度为1.5mol/L；

步骤（1）中所述的MgSO₄的终浓度为2mmol/L；

步骤（2）中所述的恒温反应的时间为50～70min。

8.根据权利要求6所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：

步骤（2）中所述的恒温反应的条件为61℃反应60min。