[发明专利]检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。 

背景技术

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）是由流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种重要的蚊媒性人畜共患传染病。JEV是引起母猪出现繁殖障碍的主要病原体之一，对猪的致死率不高，但可引起怀孕母猪流产、产死胎或木乃伊胎，也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育，给养猪业的持续发展造成较大的经济损失。因此，防制猪JE不仅可以减少养猪业的损失，而且对人类的健康发展有重要意义。 

流行性乙脑病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV），所致疾病在日本称日本乙型脑炎（JBE）。1950年以来，中国对该病进行了大量病原学和流行病学研究，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑，是中国夏秋季流行的主要传染病之一，除新疆、西藏、青海外，全国各地均有病例发生，年发病人数2.5万，病死率10%，大约15%的患者留有不同程度的后遗症。 

日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis virus）属于黄病毒科甲病毒属。该病毒呈球形，直径约40nm，二十面体立体对称的核衣壳，内有衣壳蛋白（C）与核酸构成的核心，外披以含脂质的囊膜，表面有囊膜糖蛋白（E）刺突，即病毒血凝素，囊膜内尚有内膜蛋白（M），参与病毒的装配。病毒基因组为单股正链RNA，全长11kb，自5′至3′端依次编码结构蛋白C、M、E以及非结构蛋白NS1—NS5，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白，在胞浆粗面内质网装配成熟，出芽释放。 

目前，有许多技术可用于JEV的检测，如免疫荧光法、免疫组织化学技术、直接电镜、免疫电镜、酶联免疫吸附试验、阻断ELISA、链霉亲和素-生物素技术、原位杂交法、竞争阻断ELISA。然而这些检测方法不但需要昂贵的设备仪器花费较长的时间，而且特异性和敏感性较低。因此，在实验室建立一种快速， 敏感，特异的检测JEV的诊断方法是十分必要的。 

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）：LAMP是由日本的Notomi（Notomi et al，2000）在2000年发明的一种全新的核酸扩增方法。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的4条引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下（60℃-65℃）可高效、快速、特异的扩增靶序列。LAMP法不仅能扩增DNA，也能扩增RNA，只需在反应体系中加入一定量的反转录酶就能实现扩增，整个反应时间非常短，此技术设备要求低，一个恒温箱或水浴锅就能完全反应。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人（Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol,2004May；42(5):1956-61）于2004年根据LAMP原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人（Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.Virol Methods.2007May，141(2):173-80.）于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。后来，有研究对LAMP方法作进一步改进，在原有LAMP反应试剂的基础上添加钙黄绿素和氯化锰后，可以衍生出另外一种更为简便的可视化LAMP，一步即可完成LAMP扩增及结果判定，LAMP产物无需开盖分析即可用肉眼观察结果。但这种方法因存在假阳性率过高、弱阳性结果的判别不够准确、且钙黄绿素与锰离子的浓度配比体系不稳定等缺点而使该方法的应用推广受到限制。