[发明专利]螺杆菌的体外培养

说明书

本申请是2007.11.14提交的200780041991.6，题为“螺杆菌的体外培养”的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于体外分离和/或培养螺杆菌、尤其是“暂定猪螺杆菌(Candidatus Helicobacter suis)”的方法和工具。本发明还涉及由分离的螺杆菌培养物制备抗原和疫苗。

发明背景

人群中的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染是胃和十二指肠溃疡以及胃癌的一个主要原因。幽门螺杆菌(H.pylori)不是唯一一种能在人的胃黏膜上集落化的螺杆菌。已经在约0.96%的人的胃活组织切片中发现了“海尔曼螺杆菌”(Helicobacter heilmannii，建议名)(Heilmann和Borchard(1991)Gut32，137–140)。这一生物体与胃炎密切相关，但也与消化器官溃疡、胃腺癌以及黏膜相关淋巴组织淋巴瘤相关。近期的证据显示，海尔曼螺杆菌(H.heilmannii)不是单一的物种，而是代表了具有相似的螺旋形形态的不同细菌种类，其中大部分可能具有人畜共患性起源。在16S rRNA基因序列的基础上分为1型海尔曼螺杆菌和2型海尔曼螺杆菌(Solnick等，(1993)J.Infect.Dis.168，379-385)。50%以上的人类海尔曼螺杆菌感染是由1型海尔曼螺杆菌引起的(Trebesius等，(2001)J.Clin.Microbiol.39，1510-1516)。1型海尔曼螺杆菌已被证实等同于“暂定猪螺杆菌”(Candidatus H.suis)(O’Rourke等，(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211)，后者是一种在60%以上屠宰的猪的胃中集落化的迄今无法培养的螺旋形细菌。暂定猪螺杆菌在猪的胃病中的实际作用仍不清楚，但已经指出，这一细菌与食管部()胃溃疡以及慢性幽门胃炎相关。使用小鼠接种将这一细菌从受感染的猪胃黏膜中分离出来(Dick等，(1989)J.Med.Microbiol.29，55-62)。Hellemans等人[(2005)Antimicrob.agents chemother.49，4530–4535]改进了现有的暂定猪螺杆菌感染的体内小鼠模型，用于评价这一生物体的抗生素易感性。仍未实现暂定猪螺杆菌的体外培养。

发明概述

本发明是建立在开发能够分离和培养螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌()的培养体系的基础上的，暂定猪螺杆菌在这之前未被证明能以体外分离株的形式培养。

本发明的第一个方面涉及一种用于分离螺杆菌的培养体系的应用，更具体地说，涉及一种包含固体成分的培养体系(即固体培养基)的应用，所述固体培养基包含至少7.5%血液或10%血清，其pH调节至5.0至6.0之间。

在一具体实施方式中，所述固体成分包含用于苛求生物体生长的营养素。更具体地说，这些营养素选自布氏、马-欣二氏或心脑浸液培养基。

在进一步的具体实施方式中，存在于所述固体成分中的血清是浓度至少12.5%的血清。在另一具体实施方式中，存在于所述固体成分中的血液浓度至少为10%。

更具体地说，本发明涉及在“暂定猪螺杆菌”的分离中使用上述培养体系。

在第二个方面，本发明提供了用于从含有相同螺杆菌的样品中分离螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌的方法，所述方法包括在含有pH5.0到6.0之间、补充了至少10%血清或至少7.0%血液的培养基的培养体系中培养所述含螺杆菌的样品的步骤。

在这些方法的具体实施方式中，所使用的培养基包含用于苛求菌生长的营养素。更具体地说，所述用于苛求菌生长的营养素选自布氏、马-欣二氏或心脑浸液营养素。此外或或者，在具体实施方式中，所述培养基包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质。在进一步的具体实施方式中，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

在本发明所述方法的具体实施方式中，含至少10%血清的所述培养基含有12.5和25%之间的血清。另外，含至少7.0%血液的所述培养基含有7.5和15%、尤其是10和15%之间的血液。

可选地，本发明所述方法中使用的培养基进一步包含从维生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、对氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(辅酶1)、辅羧酶、硝酸铁、硫胺和盐酸半胱氨酸中选择的一种或多种生长因子。