[发明专利]斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记、检测方法与应用

权利要求书

1.一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记，其特征在于，该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是SIEF2632F/R，其中：

SIEF2632F是：5' AACACTGAATCATCCTCCTC 3'；

SIEF2632R是：5' AGTCGCCATGATGCTTTT 3';

PCR产物大小为397bp，扩增出的SCAR片段序列如下：

AACACTGAATCATCCTCCTCATGAAAACGTGTAGCTGAAAATGGTAAAGGCTCACACAATAAGGTTGCCATGGTAGTCTCATTGGCAAAACCCAAGTTGTTCTGACTGCAGAGTGGAATGTGGAATGGATCCATCGCAAGTGCTTGTTTCCTCTCCCTGCCAGCGGAGTTCAAAAATACCGACCTCTCGACAAGGACCACGCGTCGGGAAGTAGACTAGATAAGACCCACTACTAAAGTAGCGGGAATTTCTCAAATCGAAACCTGCGTTATGTCGTACCTGTCGCGTGCAAACCTGAAGGAAAGGGAAGCTATGTTTTCTGAGGGACCAGAGCTATACACGGGAGATATCCAAGCCGCTCTGTCCAGCGAATTTAGAAAAAAGCATCATGGCGACT。

2.权利要求1所述的一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）培养斑玉蕈菌种，收集菌丝，或直接采集斑玉蕈子实体，于-20℃保存；培养斑玉蕈菌种时，将所述斑玉蕈菌种转接到PDA平板上，25℃避光培养，15d~20d ; （2）提取菌丝的基因组DNA；（3）将提取的DNA利用权利要求1中所述的SIEF2632F/R引物对进行基因SCAR的PCR扩增，获得扩增产物，将提取的DNA进行基因SCAR的PCR扩增的方法如下：扩增体系的总体积为25μL：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/LMgCL₂1.75μL，10mmol/LdNTPs 0.25μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10μmol/L SIEF2632F/R引物各0.5μL，25ng/μL模板DNA0.5μL，ddH₂O18.75μL，PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7 min；（4）电泳检测，取上述PCR扩增产物电泳，在凝胶成像仪上照相，分析结果，电泳检测方法如下：取所述PCR扩增产物3μL，与0.6μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，在0.5×TAE的缓冲液中、120V的电压下电泳40 min，电泳结束后，使用EB（溴化乙锭）染色，在凝胶成像仪上照相，分析结果。

3.根据权利要求2所 述的方法，其特征在于，步骤（2）中，使用如下的CTAB法提取菌丝的基因组DNA：1）将-20℃冷冻干燥的斑玉蕈菌丝或子实体研磨成粉末，加入 65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀； 2）12000rpm,4℃离心20min，取上清液；3）加入等体积的酚：氯仿，体积比为1：1，混匀10min，12000rpm,4 ℃离心10min，取上清液移入离心管中；4）加入等体积的氯仿：异戊醇，体积比为24：1，轻轻混匀10min，12000rpm,4℃离心 10min，取上清液移入心管中；5）加入等体积预冷的异丙醇、1/10体积的3mol/L醋酸钠，-20℃放置20min，12000rpm，4℃离心10min，去上清； 6）沉淀用75%乙醇洗涤2～3次，每次8000rpm,室温离心5min，弃上清；7）将沉淀真空抽干或自然晾干；加入100μL TEbuffer或双蒸水，使沉淀溶解； 8）加入1μL 10mg/mL RNaseA 37℃水浴，1hr，去除RNA，获得DNA提取物，于-20℃贮藏备用。

4.权利要求1所述的一种斑玉蕈菌株SIEF2632的分子标记在鉴定斑玉蕈菌株SIEF2632中的应用，其特征在于，是将所述斑玉蕈菌株SIEF2632采用权利要求1中的SIEF2632F/R引物对进行PCR扩增，能扩增出397bp条带的即为斑玉蕈菌株SIEF2632。