[发明专利]一种使用病毒诱导的基因沉默系统培育雄性不育植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及以生物技术手段培育雄性不育植株的载体系统和方法，尤其涉及双子叶植物。

背景技术

培养拥有不育性稳定，彻底，各方面性状良好的雄性不育株系是实现植物杂交育种目标的关键。目前，生产上培育雄性不育株系的主要途径有胞质不育系统、核不育系统和化学杀雄系统等。

细胞质雄性不育是当前油菜杂种优势利用中应用最广泛而又最有效的途径之一，但是该系统不育系的不育性不够彻底、易受环境温度的影响。在初花期低温条件下易出现微量花粉，微粉的产生将迫使母本自交结实，使F1代种子恢复度降低，在生产上应用存在一定风险。例如，对于油菜来说，胞质不育系统微粉问题是目前国内外育种界尚未彻底攻克的技术难题，也是油菜三系制种普遍存在的一大隐患。细胞核不育系不育性彻底稳定，不受环境条件影响，恢复系多，易获得强优势组合。该系统的不足之处在于其不育系中存在50％可育株，在亲本繁殖和杂交种生产中要人工去除不育系中50％的可育株，导致生产成本增加，而且一旦去除不及时，杂交种中会出现一定比例的不育株系。经过改进，人们育成了隐性和显性核不育三系，解决了核不育亲本繁殖和杂交种制种过程中需要拔除50％可育株的难题，但是该系统存在保持系较少、亲本选育较难的问题。化学杀雄是指在植物雄性器官分化前或发育过程中，喷施内吸性药剂，经过一系列生理生化过程，以阻止花粉的形成或抑制花粉的正常发育，而导致的雄性不育。利用化学杀雄剂培育品种是一种新型的油菜育种方法，在国内外应用较为广泛，但是该系统杂交种由于易受外界条件影响、田间操作繁琐，而且由于农药残留等问题，在生产上大面积应用也存在一定局限性。

近来的分子生物学研究中，利用生物技术手段来培育雄性不育植株是一个重要的研究方向。与传统不育系选育相比，生物技术不育系的培育可以不受遗传资源的限制，通过转基因等可以从分子水平上改变植物育性的手段实现。然而，利用转基因生物技术培育的稳定不育系不仅面临着转基因扩散的安全问题，而且同样存在上述细胞核不育系的缺点。

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)也是一种可用于调控植物内源基因表达水平的生物技术。VIGS引起的基因沉默是一种转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象，是植物体内普遍存在的遗传免疫机制。VIGS技术通过在病毒载体中插入目的基因片段，并侵染寄主植物，利用植物体内天然存在的遗传免疫机制，将内源目的基因mRNA降解，使植物出现目的基因功能丧失或表达水平下降的表型。与植物转基因技术相比，VIGS无需培育转基因植株，而且具有操作简便、获得表型快速等优点，目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究。但是，利用VIGS技术沉默植物内源基因一直存在一个沉默效率的问题，一股获得有表型材料的比例低于30％，限制了这一技术应用。

发明内容

本发明的目的在于利用生物技术建立不受育种资源限制、可利用现有可育优质种质资源，快速培育不育性彻底稳定及性状优良的雄性不育系，而且具有田间操作简单、制种成本低的授粉控制系统。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用。

优选地，上述VIGS载体系统来源于烟草脆裂病毒(TRV病毒)，包括辅助病毒载体pTRV1(含TRV病毒的RNA1片段)和表达病毒载体pTRV2(含TRV病毒的RNA2片段)。

上述pTRV1载体包括以下结构：依次为左边界(LB)、2×35S启动子、2×35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、富半胱氨酸16K蛋白、运动蛋白(MP)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(NOS_t)、右边界(RB)；上述pTRV2载体包括以下结构：依次为左边界(LB)、2×35S启动子、2×35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒外壳蛋白(CP)、多克隆位点(MCS)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(NOS_t)、右边界(RB)。如图9所示。在利用VIGS方法沉默植物基因时，利用pTRV2载体CP和Rz之间的多克隆位点(MSC)将靶基因片段构建在的pTRV2载体中。pTRV1和pTRV2载体均有T-DNA的左右边界，用于在侵染植物过程中将载体中的目的片段导入植物细胞，以启动烟草脆裂病毒的复制。pTRV1含TRV病毒的RNAl cDNA克隆，为病毒复制组装所必须；pTRV2含TRV病毒RNA2cDNA克隆和多克隆位点(MCS)。