[发明专利]一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉、生产方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂的米曲霉，同时还涉及该米曲霉转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂的方法及应用，属于中药技术领域。

背景技术

人参(Panax ginseng G.A.Meyer)是我国珍贵的传统中药，应用于中医临床已有两千多年的历史。人参的主要活性成分是人参皂苷(ginsenoside)，其中，原人参二醇类皂苷属于达玛烷型四环三萜皂苷，主要包括Rb₁、Rc、Rd、Rg₃以及Rh₂等。其中，人参皂苷Rg₃和Rh₂均有十分重要的药用价值，相对于人参皂苷Rh₂，实际应用中由于Rg₃水溶解性较低，一定程度上限制了药效。此外，人参皂苷Rg₃的获得也相对容易，而且它的结构仅比人参皂苷Rh₂多了一个糖基，因此可通过水解Rg₃中多出的糖基获得Rh₂。张丹等(高产人参皂甙β-葡萄糖苷酶菌种的筛选，大连轻工业学院学报，2000)从8种菌种中筛选出一株高产人参皂苷葡萄糖苷酶的菌种黑曲霉(Aspergillus niger)，由该菌种发酵液中获取的粗酶液可以转化Rg₃形成Rh₂，转化率高达43％，而且形成的Rh₂不会被进一步降解。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂的米曲霉。

本发明的目的还在于提供一种米曲霉在转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂方面的应用。

本发明的目的还在于提供一种米曲霉转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂的米曲霉，所述米曲霉保藏名称为米曲霉Aspergillus oryzae AS.mq01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M2013430，保藏日期：2013年9月17日。

米曲霉是一种好气性真菌，菌丝有多细胞组成，可产淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶等，是一类产复合酶的菌株，可用于生产各种酶制剂。利用米曲霉活性强大的酶系，降解人参皂苷Rg₃分子上的糖基，使其转化为人参皂苷Rh₂，可提高人参皂苷的生物利用度。

本发明筛选得到的米曲霉代谢产物中含有能强烈水解人参皂苷Rg₃的人参皂苷糖苷酶，在24小时内转化人参皂苷Rg₃形成Rh₂的转化率最高可达56.6％，而且，转化形成的 Rh₂不会进一步分解转化。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种米曲霉在转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂方面的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种米曲霉转化人参皂苷Rg₃生产Rh₂的方法，包括以下步骤：

(1)菌株的准备：将米曲霉活化并发酵培养；

(2)酶液的制备：将步骤(1)的发酵液过滤，滤液离心，去除菌体沉淀，收集上清液；在上清液中加硫酸铵至60-80％饱和度；4-8℃静置过夜，离心，弃上清液，收集蛋白质沉淀；蛋白质沉淀用0.02mol/L，pH4.5-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后装入透析袋，用相同的醋酸-醋酸钠缓冲液透析24-36h；透析后，离心，上清液即为粗酶液；

(3)酶液的转化反应：称取人参皂苷Rg₃，用0.02mol/L，pH4.5-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rg₃浓度为0.5～1mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在35-45℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，得到人参皂苷Rh₂。