[发明专利]纯化水溶性氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法，具体是涉及一种高效纯化水溶性羧基化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物的新方法。

背景技术

链霉亲和素是一种与亲和素有相似生物学特性的蛋白质，可以高度特异性地结合一种水溶性的维生素：D-生物素，其与生物素的亲和力非常强，它们之间的Kd值接近10-15M。完整的链霉亲和素是由四条相同肽链组成的四聚体，总分子量约为66.5kDa，并且每一个链霉亲和素分子可以紧密结合四个生物素分子，平均每条肽链（单体）可以结合一个生物素分子。完整的四聚体链霉亲和素还具有热稳定性好，对强酸、十二烷基磺酸钠、尿素、盐酸胍的耐受性强等特点，这些特点使得生物素-链霉亲和素系统具有高亲和力、灵敏度高、特异性强、稳定性好，信号放大作用等众多优势，此外生物素具有非常易于与种类繁多的生物活性分子（如蛋白，核酸和糖类等）发生偶联的优点，使得生物素-链霉亲和素广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域，并已经取得较好的效果。

自上世纪60 年代人工制造出磁性纳米颗粒后，磁性纳米材料的合成和应用等方面得到了迅速发展。近年来磁性纳米粒子已在各个领域得到广泛应用，如：生物分离、药物转运、过热治疗、酶的固定、免疫测定、组织修复和磁共振成像等。但是，磁性纳米粒子具有较高的表面能，在溶液相中具有强烈的聚集倾向，使得磁性纳米粒子在应用方面受到很大限制，特别是在生物和医药等领域，要求磁性纳米粒子具有很好的稳定性、生物相容性和生物可降解性。通过表面共聚和表面改性，可降低纳米粒子的表面能，由此获得可溶性或可分散性好的纳米粒子。经过处理后形成的磁性复合粒子既具有磁性，又具有表面活性基团，能进一步与药物、抗体、蛋白质、酶、细胞及DNA等多种分子偶联，可利用外部磁场靶向器官、组织或肿瘤。磁性纳米粒子的种类有很多，比较常见的有Ni、Fe、Co及其合金，氧化铁，铁氧体，其中以氧化铁(γ -Fe₂O₃，Fe₃O₄)磁性材料的应用最为广泛。在众多磁性纳米生物材料中，Fe₃O₄纳米粒子（iron oxide nanoparticles，IOs ）（粒径小于10nm）由于具有优越的超顺磁特性、非免疫原性、低毒性及较好的生物相容性，已在许多生物医学方面展示了独特的优势。然而，磁性纳米粒子并不具有链霉亲和素分子高亲和性，因此往往需要在其表面偶联上链霉亲和素分子形成磁性纳米粒子链霉亲和素偶联物。这样，这种偶联物就同时拥有了磁性纳米粒子的磁性等特殊的理化性质和链霉亲和素分子的高亲和性。

总之，作为一种新型的生物标记物，氧化铁纳米粒子由于其特殊的理化性质，结合有机染料或荧光染料后，在细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及荧光标记的免疫学快速诊断技术等领域具有更为显著的优势。其中羧基功能团表面的水溶性氧化铁纳米粒子应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性氧化铁纳米粒子转化为羧基表面的水溶性氧化铁纳米粒子最常用方法。

由于链霉亲和素结合生物素类似于化学偶联的亲和效果，因此氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联产物被认为制备各类生物荧光探针的共同载体得到了广泛的应用。羧基化氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联常用方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在氧化铁纳米粒子与链霉亲和素质偶联过程中，将氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物与溶液中游离链霉亲和素进行高效分离，是保证氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物使用效率的前提。目前，氧化铁纳米粒子链霉亲和素标记探针纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。由于水溶性氧化铁纳米粒子纳米粒子粒径小，比表面积大，纳米材料与链霉亲和素偶联物表面含有大量的羧基，因此采用常规离心（低于30，000 g离心力），氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物回收效率普遍偏低（小于50%），若要将氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物回收效率提高至90%以上，离心速度一般需大于50，000 g。 第二种常见纯化方法为凝胶色谱法。该方法利用氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物与标记链霉亲和素的分子量差异（表现为光学以及水化粒径的差异），利用排阻层析原理进行分离。第三种常用分离方法为超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将标记链霉亲和素与氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的氧化铁纳米粒子链霉亲和素偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产。