[发明专利]一种胰蛋白酶精品的生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，设计药用胰蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取胰蛋白酶。

背景技术

胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它主要的功用有：能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。

用传统的方法仅提取胰蛋白酶是相当困难的。2006年7月上海阿敏制药有限公司公开了一种糜胰蛋白酶的制备方法(200610023582.0)，其采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、乙醇醇析的产品工艺，得到糜胰蛋白酶。2011年1月马忠仁等申请了一种提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682.X)，其采用了CaCl2激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的(NH4)2S04，使其生成硫酸钙沉淀吸附糜胰蛋白酶，经过洗脱、盐析、超滤和冻干获得白色的糜胰蛋白酶的冻干粉末。产品均为糜胰蛋白酶，没有单纯的胰蛋白酶提取分离纯化。

发明内容

本发明的目的就是为了生产高质量的胰蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种提取胰蛋白酶方法。

本发明的技术方案是：利用硫酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理，调节pH，硫酸铵分级盐溶、盐析将胰蛋白酶原等沉淀析出，再将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干的方法，即可得较高纯度的胰蛋白酶，包括如下步骤：

1、胰蛋白酶粗制生产操作：

(1)提取工序：将新鲜的胰脏绞碎成胰浆，称重。按每千克胰浆加入2-3L的0.1-0.2mol／L硫酸溶液，浸渍20-28小时，将浸渍物置滤袋过滤，滤干后弃去滤渣，留取滤液；

(2)盐溶工序：浸渍液中加入硫酸铵，达到30-50％饱和度，静置10-16小时，过滤，留取滤液；

(3)盐析工序：滤液中加入硫酸铵，达到50-80％饱和度，静置10-16小时，过滤，留取滤饼；

(4)每克滤饼加入2-5ml的水溶解，重复上述(2)、(3)操作；

(5)每克滤饼用1-3ml的水溶解，然后每克滤饼中加入0.1-1ml的饱和硫酸铵溶液，调节pH至4.0-6.0；

(6)结晶工序：溶液在20-30℃温度中静置24-72小时，有针状糜蛋白酶结晶析出；离心，调节pH至2.0-5.0，每1000ml溶液中加300-400g固体硫酸铵，达到50-80％饱和度，静置12-16小时，抽滤；

(7)干燥工序：取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品。

2、胰蛋白酶精制生产操作：

(1)投料：称取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2～4ml的水搅拌溶解，调节pH至3.0±0.5，以助其溶解，搅拌10～16小时；计量溶液体积，按400～500g／L比例加入固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10～16小时；

(2)盐溶：将溶液过滤，称量滤饼重量，先按每克滤饼加入2-4ml的水，搅拌溶解后，调节pH至3.0±0.4，再按每克滤饼加入1～3ml的饱和硫酸铵溶液静止沉淀10～16小时；

(3)盐析：将溶液过滤，量取滤液体积，加入等体积量的饱和硫酸铵溶液，静置沉淀10～16小时；

(4)洗镁：将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重，待活化；

(5)活化：称滤饼重量为A千克，将滤饼溶于3A～5A升的0.001～0.01m0l／L盐酸溶液，另加入0.5～2mol／L氯化钙溶液A～3A升及pH7.5～8.5硼酸缓冲液4A～6A升，再加入6A～9A升的水，调节pH至7.0～8.0，最后每克滤饼加5～15mg的结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液置0～10℃中静置60～80小时进行活化，pH控制在7.0～8.0；

(6)除钙：活化后的溶液，调节pH至3.0±0.4，再按200～300g／L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在0～10℃中存放32～60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液按150～250g／L加入固体硫酸铵，在0～10℃中静置10～14小时，过滤，得滤饼；